嚙齒類動物類風濕性關節(jié)炎模型制備方法統(tǒng)計分析

王凱濤，譚荃荃，周凡琦，運晨霞，2

（1.廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧 530200；2.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結合轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，廣西 南寧 530200）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以關節(jié)滑膜增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成及關節(jié)軟骨和骨基質(zhì)破壞為主要特征，病變呈對稱性、破壞性發(fā)展，最終可導致關節(jié)畸形和功能喪失，目前臨床尚無治療RA 的特效藥物［1］。

RA動物模型是研究RA發(fā)病機制以及尋找有效治療方法的主要手段，理想的RA動物模型應具備以下特點:一是模型在病因?qū)W與發(fā)病機制方面與人類相似；二是模型的發(fā)病過程、臨床癥狀、免疫病理特點應與人類相似；三是模型容易獲得，施加相同實驗條件獲得的結果相同，能夠檢測到機體免疫系統(tǒng)的變化；四是模型應具有穩(wěn)定性、可重復性、成本低和易操作的特點。因此，建立一種成熟、穩(wěn)定的RA 模型具有重要意義。

1976 年開始，不斷有人利用動物模型研究RA，曾用來制作RA 模型的動物包括:大鼠、小鼠、兔、恒河猴、犬、豚鼠［2-3］?？偟膩碚f，應用大鼠、小鼠作為研究類風濕性關節(jié)炎的動物模型比較多，原因是大型動物雖然在體型、解剖學及治療應答方面與人較為相似，但因其成本高、操作困難以及穩(wěn)定性相對較差等，阻礙了這些動物模型的深入發(fā)展和更廣泛的應用，而大鼠、小鼠以其高繁殖、易飼養(yǎng)、穩(wěn)定的近交系等特點，成為實驗室里常用的實驗動物。本研究查 閱了2000 年1 月1 日至2017 年12 月31 日國 內(nèi) 公開發(fā)表的有關大鼠、小鼠類風濕性關節(jié)炎的實驗研究論文，并對其中大鼠、小鼠的造模研究方法以及大鼠、小鼠RA模型的優(yōu)缺點進行了歸納與分析?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 研究方法

1.1文獻檢索 以“類風濕性關節(jié)炎”“動物模型”“分析”等為關鍵詞，手工查閱2000 年1 月1 日至2017 年12 月31 日中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（CNKI）發(fā)表的相關文獻。檢索得到文獻篇數(shù)370 篇，其中與大鼠有關的文獻為332篇，與小鼠有關的文獻為38篇。

1.2文獻質(zhì)量分析 本文查閱的相關文獻中所涉及樣本均由正規(guī)實驗動物中心提供或代養(yǎng)，樣本分別從膝關節(jié)滑膜病理形態(tài)學觀察、大小鼠踝關節(jié)病理變化、大小鼠關節(jié)X 線表現(xiàn)等方面測定建立類風濕性關節(jié)炎模型的有效性，均為可靠有效的樣本。

2 結 果

2.1動物品系及性別的選擇 見表1～表4。

表1～表4 結果顯示，用作類風濕性關節(jié)炎模型的大鼠品系主要有Wistar 大鼠和SD 大鼠兩種，所占比例分別為49.09%和41.58%；用作類風濕性關節(jié)炎模型的小鼠品系較多，主要有DAB-1 小鼠、BALB/C小鼠和昆明小鼠，所占比例分別為39.47%、26.32%和21.05%，其他小鼠品系為13.16%。而實驗動物的性別主要以雄性為主，其中雄性大鼠所占比例為78.61%，雄性小鼠所占比例為47.37%。

表1 大鼠品系選擇及所占比例 （n=332）

表2 小鼠品系選擇及所占比例 （n=38）

表3 大鼠品系性別選擇及所占比例（n=332）

表4 小鼠品系性別選擇及所占比例 （n=38）

2.2致敏方法 類風濕性關節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，模型的制備有誘導式、轉(zhuǎn)基因式和自發(fā)式3種［4-5］，本文主要分析文獻中誘導式的造模方法。

2.2.1致敏藥物 常用制備RA 模型的誘導藥物是佐劑和Ⅱ型膠原蛋白，此外偶見使用降植烷、熱殺死結核分支桿菌（Mtb）等藥物。

2.2.1.1佐劑 佐劑分為弗氏完全佐劑（Freund′s complete adjuvant，CFA）和弗氏不完全佐劑（incomplete Frennd′s adjuvant，IFA）。CFA是用液體石蠟與無水羊毛脂配制，兩者按2∶1 或6∶4 的比例混合，將混合液1 ml 經(jīng)過高壓滅菌后再加入80 ℃滅活1 h 的減毒卡介苗（Mtb）或干燥結核死菌10 mg 來制成。其中不加卡介苗的則為IFA。佐劑誘導的關節(jié)炎模型，稱為佐劑型關節(jié)炎模型（AA）［6］，此模型是細菌學家Freund于20世紀50年代創(chuàng)立的，是研究免疫性關節(jié)炎動物模型的基本方法。造模方法是將Mtb 與礦物油混勻制備成弗氏完全佐劑，一次性經(jīng)尾根部皮下注射，誘導SD大鼠發(fā)展成為實驗性RA模型。

2.2.1.2Ⅱ型膠原蛋白 正常情況下，機體內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，）是一種與免疫系統(tǒng)隔絕的蛋白，但在某些病理條件下卻可作為一種自身抗原呈現(xiàn)出來，誘導機體產(chǎn)生關節(jié)炎性質(zhì)的自身免疫病。研究表明，雞、小牛、大鼠的Ⅱ型膠原蛋白均能引起嚙齒類動物或靈長類動物的關節(jié)炎。Ⅱ型膠原蛋白誘導的關節(jié)炎稱為膠原型關節(jié)炎（CIA），是Trentham 等［7］于1977年創(chuàng)立的。造模方法是通過將天然Ⅱ型膠原蛋白的醋酸溶液與等量的弗氏完全佐劑或不完全佐劑乳化，在實驗動物背部皮內(nèi)、尾根部皮內(nèi)和足跖部注射，誘導大鼠出現(xiàn)關節(jié)炎癥的表現(xiàn)。

2.2.1.3其他藥物 根據(jù)實驗目的的不同，也有選擇其他藥物制備類風濕性關節(jié)炎模型。有直接用熱滅活的Mtb 誘導關節(jié)炎大鼠模型［8］；蛋白聚糖誘導的小鼠關節(jié)炎模型（proteoglycan-induced arthritis，PGIA）［9-10］；鏈 球 菌 細胞 壁 誘 導 的 關 節(jié) 炎 模型［11］；抗Ⅱ型膠原單克隆抗體誘導的CAIA 模型［12］；降植烷誘導的PIA 模型［13］；卵清蛋白誘導的OVA 模型等［14］。

經(jīng)分析文獻，在致敏藥物的選擇上，大鼠主要選用弗氏完全佐劑和Ⅱ型膠原蛋白兩種藥物造模，而小鼠主要選用Ⅱ型膠原蛋白作為造模藥物，其他藥物選用的比例較低。見表5。

表5 大、小鼠致敏藥物的選擇

2.2.2藥物致敏劑量的選擇 在模型制備過程中，藥物致敏的劑量類別比較多，見表6。從表6 可以看出，大鼠的注射劑量主要為每只0.1 ml，小鼠的注射劑量主要為每只0.01 ml。

表6 大、小鼠藥物致敏劑量

2.2.3藥物的致敏次數(shù) 機體的免疫反應隨著致敏次數(shù)的增加越來越強，因此在誘導自身免疫性炎癥的過程中，致敏藥物的類別與致敏的次數(shù)也很重要。經(jīng)統(tǒng)計，用CFA 致敏以1 次為主，占86.67%；而Ⅱ型膠原蛋白主以2次致敏為主，大、小鼠分別為66.67%和51.72%。結果見表7。

表7 藥物致敏次數(shù)

2.2.4致敏與激發(fā)間隔天數(shù) 第一次致敏與第二次激發(fā)的間隔時間也會影響到機體的免疫反應，經(jīng)統(tǒng)計，大鼠致敏與激發(fā)間隔天數(shù)多數(shù)為7 d，占66.26%；而小鼠致敏與激發(fā)間隔天數(shù)多數(shù)為21 d，占63.16%。結果見表8。

表8 藥物致敏與激發(fā)間隔天數(shù)

3 討 論

統(tǒng)計結果表明，制備類風濕性關節(jié)炎模型時大鼠主要選用Wistar 和SD 大鼠，小鼠主要選用DBA/1和BALB/C 小鼠，原因是Wistar大鼠更易誘導形成類風濕性關節(jié)炎模型［15］，而DBA/ 1 小鼠模型通常在初次接種后21～25 d發(fā)生，呈現(xiàn)為多發(fā)性關節(jié)炎，其在肢體中最突出，其特征在于滑膜炎癥浸潤，軟骨和骨侵蝕以及類似于人RA 的滑膜增生。性別選擇中雄性大鼠的使用頻率遠高于雌性大鼠。主要是考慮到雌性動物有明顯的性活動周期，內(nèi)分泌因素會影響實驗的結果。

對類風濕性關節(jié)炎致敏藥物的選擇較為一致，大鼠大多數(shù)采用注射CFA致敏，且用足跖部注射，使用劑量以0.1 ml 為宜，多數(shù)為一次免疫；在二次免疫中，多數(shù)在第7 天進行第二次致敏。而小鼠大多采用誘導類風濕性關節(jié)炎，且多數(shù)為二次免疫，兩次均在尾根部注射，使用劑量為0.01 ml 為宜，多數(shù)在第21天進行第二次致敏。

由于大、小鼠的易感類風濕性關節(jié)炎的情況不同，大鼠主要應用于佐劑誘導的關節(jié)炎造模，小鼠主要應用于膠原誘導的關節(jié)炎造模。AA 大鼠和CIA小鼠在臨床表現(xiàn)、實驗室指標和病理機制上，既有各自特點，又有許多相似之處，且與人RA在臨床表現(xiàn)、病理、免疫有著相似或相近的特點。CIA 是目前公認的研究RA 病理機制和評價治療藥物的最佳動物模型，AA大鼠模型在我國被廣泛用于RA或防治RA藥物的研究，兩者均為有效的類風濕性關節(jié)炎模型。