線粒體糖尿病患者三例及其家系的臨床及基因檢測分析

張娜娜，黃有燁，王祺，章秋，胡紅琳*

線粒體糖尿?。╩itochondrial diabetes mellitus，MDM）是一組因線粒體基因（mitochondrial DNA，mtDNA）缺陷導(dǎo)致組織能量代謝障礙所引起的異質(zhì)性疾病，因其遺傳特點表現(xiàn)為嚴(yán)格的母系遺傳且多伴有神經(jīng)性耳聾，故又稱為母系遺傳糖尿病伴耳聾（maternally inherited diabetes and deafness，MIDD）。因早期臨床表現(xiàn)不典型，多數(shù)MDM患者表現(xiàn)類似于2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），少數(shù)患者因發(fā)病年齡較小而常被診斷為1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM），因此MDM常容易誤診，不能得到規(guī)范診治且影響患者預(yù)后的判斷。已報道的與MDM發(fā)生相關(guān)的mtDNA突變位點達幾十種，其中最常見的是線粒體tRNA Leu（UUR）3243A→G點突變，約占85%［1］。本研究對3例臨床疑診為MDM的患者行線粒體疾病基因檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果及相關(guān)文獻報道指導(dǎo)患者治療。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017—2019年在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及六安市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科疑診為MDM的3例患者，均為女性，發(fā)病年齡17～27歲。將3例先證者及其7名家系成員納入研究，并行mtDNA測序。本研究已通過安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 本研究基于現(xiàn)有資料，采用真實世界研究方法收集研究對象臨床資料，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測量身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍，并以體質(zhì)量（以kg為單位）除以身高（以m為單位）的平方計算體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）、以腰圍（以cm為單位）除以臀圍（以cm為單位）計算腰臀比（waistto-hip ratio，WHR）。隔夜空腹8 h后抽取研究對象肘靜脈血10 ml用于檢測糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）、糖尿病相關(guān)抗體及進行基因測序，同時先證者及明確糖尿病診斷者行饅頭餐試驗，未確診者行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），分別于0、30、120 min抽取其肘靜脈血3 ml。采用全自動生化分析儀（HITACHI 7170S Japan）測定血糖（blood glucose，BG），采用化學(xué)發(fā)光法（ChemiLuminescence）測定C肽（C peptide，CP），采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，BIO-RAD）測定HbA1c，采用免疫印跡法（Western blotting，SIEMENS）測定糖尿病相關(guān)抗體。采用血液基因組柱式中量提取試劑盒（天根）提取基因組DNA，用Qubit 2.0型熒光計及0.8%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣本進行質(zhì)檢，通過Illumina公司NovaSeq 6000系列測序儀進行高通量測序（PE150），目標(biāo)序列測序覆蓋度不低于99%。線粒體3243位點的測序或mtDNA的測序由北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心完成。

2 結(jié)果

2.1 先證者一般資料 3例先證者一般資料見表1。

2.2 先證者臨床特點 患者1，女，34歲，27歲診斷為糖尿病，29歲出現(xiàn)聽力減退。目前使用胰島素治療。母親、姨娘、哥哥有糖尿病病史，父母非近親結(jié)婚。BMI 18.3 kg/m2，WHR 0.86。饅頭餐結(jié)果示0、30、120 min BG分別為12.06、16.26、25.14 mmol/L，CP 分別為0.39、0.47、0.85 μg/L。HbA1c為10.1%。糖尿病相關(guān)抗體陰性。該家系4代共15人，其中接受調(diào)查的共6人〔Ⅱ-2，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅲ-1，Ⅲ-3（患者1），Ⅳ-2〕，其余親屬拒絕接受調(diào)查（見圖1）。

患者2，女，27歲，26歲診斷為糖尿病，27歲出現(xiàn)聽力減退。目前使用胰島素治療。家族史不詳。BMI 14.8 kg/m2，WHR 0.81。饅頭餐結(jié)果示0、30、120 min BG分別為5.10、7.97、22.78 mmol/L，CP分 別 為 0.18、0.30、1.53 μg/L。HbA1c為13.8%。糖尿病相關(guān)抗體陰性。患者2自幼被領(lǐng)養(yǎng)，故未分析家系成員。

患者3，女，19歲，18歲診斷為糖尿病，暫無聽力減退。目前使用胰島素治療。母親、兩個姨娘、妹妹有糖尿病病史，父母非近親結(jié)婚。BMI 14.4 kg/m2，WHR 0.80。饅頭餐結(jié)果示0、30、120 min BG分別為4.27、5.25、11.21 mmol/L，CP分別為0.36、0.60、2.85 μg/L。HbA1c為5.3%。糖尿病相關(guān)抗體陰性。該家系3代共11人，其中接受調(diào)查的共3人〔Ⅱ-4，Ⅲ-1（患者3），Ⅲ-2〕，僅患者3接受基因檢測，其余親屬拒絕接受調(diào)查（見圖2）。

2.3 先證者1家系成員一般資料及生化指標(biāo) 先證者1家系成員一般資料及生化指標(biāo)見表2、3。

2.4 先證者3家系成員一般資料及生化指標(biāo) 先證者3家系成員一般資料及生化指標(biāo)見表4、5。

2.5 基因測序結(jié)果 對先證者及其家系成員共8人進行基因測序，共6人存在tRNA 3243A→G點突變，分別為家系1中先證者1、Ⅱ-4、Ⅲ-1、Ⅳ-2及先證者2、先證者3。先證者1及其家系成員基因測序結(jié)果見圖3。

表1 3例先證者一般資料Table 1 General information of 3 cases of proband

圖1 先證者1家系圖Figure 1 Family chart of proband 1

圖2 先證者3家系圖Figure 2 Family chart of proband 3

3 討論

線粒體是除細胞核外唯一攜帶遺傳物質(zhì)的細胞器，而mtDNA由37個基因組成，包含2個rRNA基因、13個多肽編碼基因和22個tRNA基因。因mtDNA缺少組蛋白保護及有效的自我修復(fù)機制，故易發(fā)生基因突變，在糖尿病患者中mtDNA的突變率約為1.5%，其中又以tRNA Leu（UUR）3243A→G點突變最為常見［2］，而在有糖尿病家族史、發(fā)病年齡早（≤45歲）、非肥胖體型、使用胰島素治療的人群中突變率增至2.5%～11.1%［3-4］。1992年，VAN DEN OUWELAND等［5］報道了首例mtDNA tRNA 3243A→G突變引起的MDM的家系。1995年，項坤三等［6］首次在我國報道了tRNA 3243A→G點突變引起的MDM。自此研究者們開始重視對MDM的研究。

表2 先證者1家系成員一般資料Table 2 General information of the family members of proband 1

表3 先證者1家系成員生化指標(biāo)Table 3 Biochemical parameters of the family members of proband 1

表4 先證者3家系成員一般資料Table 4 General information of the family members of proband 3

圖3 先證者1及其家系成員基因測序結(jié)果Figure 3 Pedigree gene sequence of proband 1 and her family members

表5 先證者3家系成員生化指標(biāo)Table 5 Biochemical parameters of the family members of proband 3

本研究3例患者發(fā)病年齡較低，均為非肥胖體型，均存在胰島β細胞功能障礙，胰島素相關(guān)抗體檢測均陰性，患者1、患者2早期即出現(xiàn)聽力減退。研究發(fā)現(xiàn)，MDM患者易出現(xiàn)聽力障礙，且男性聽力受損程度更重，進展更快［7］。耳蝸是MDM患者聽力受損的主要部位，OLMOS等［8］研究發(fā)現(xiàn)，tRNA Leu（UUR）3243A→G突變可使內(nèi)耳血管邊緣細胞腺苷三磷酸減少，并致使柯蒂氏器外毛細胞放大聲波所需能量較少，故而導(dǎo)致聽力受損。RAUT等［9］通過植入人工耳蝸治愈了MDM患者的聽力障礙，也側(cè)面印證了損傷部位在耳蝸。本研究3例先證者由于發(fā)病年齡較低（＜30歲）且體型偏瘦、血糖控制較差，血清空腹CP水平低而一直診斷為T1DM，但經(jīng)仔細詢問病史及伴隨癥狀、認真體檢后發(fā)現(xiàn)其早期即表現(xiàn)為聽力減退，且第一例先證者有明確家族史、家系成員亦伴聽力障礙而擬診為MDM，再進一步完善基因檢測后明確3例患者均攜帶tRNA 3243突變基因。先證者1有明顯的母系遺傳特點，先證者1兄妹兩人及其母親均為糖尿病患者，父親無糖尿病病史；對該家系中共6人行基因檢測，共發(fā)現(xiàn)4人攜帶tRNA 3243突變基因，其中3例已表現(xiàn)為糖尿病，2例伴有聽力減退，先證者1女兒（Ⅳ-2）攜帶tRNA 3243突變基因但暫未表現(xiàn)為糖尿病及無聽力下降，因其母親（Ⅲ-3）亦攜帶tRNA 3243突變基因，因此需定期監(jiān)測其血糖及聽力，以早期做出診斷。先證者3亦有明顯的母系遺傳特點，先證者3姐妹兩人、母親及兩個姨娘均為糖尿病患者，發(fā)病年齡均約為20歲，其母親及姨娘均伴有聽力減退。雖先證者3及其妹妹暫未表現(xiàn)為聽力減退，但因先證者3檢出tRNA 3243突變基因，故需定期監(jiān)測先證者3姐妹兩人的聽力。

因MDM的主要發(fā)病機制為胰島β細胞分泌胰島素障礙，且mtDNA突變會加重β細胞凋亡［10］，故MDM一經(jīng)確診，應(yīng)早期予以胰島素治療。對于藥物治療，雖然二甲雙胍為糖尿病的首選及一線用藥，但因其會抑制線粒體的氧化還原作用，加重乳酸酸中毒風(fēng)險，故MDM患者不宜使用［11］；此外，NINOMIYA等［12］研究表明，吡格列酮在MDM患者中也有一定作用，其原因可能與提高血漿脂聯(lián)素水平從而改善脂肪組織功能障礙相關(guān)，這為MDM患者的藥物治療提供了另一個方向。另外，一些改善線粒體能量代謝的藥物也可以作為MDM的輔助用藥，包括輔酶Q10［13］、硫辛酸［14］等，但是基因治療才是根本治療。TACHIBANA等［15］已成功通過基因移植在猴子模型中成功進行了基因治療，而TONIN等［16］設(shè)計的特殊的RNA分子導(dǎo)入培養(yǎng)人體細胞的線粒體后成功降低了DNA突變率，提示了基因治療將來可能用于治療MDM，但目前尚未應(yīng)用于臨床，仍需進一步探索。

綜上所述，對于發(fā)病年齡低、非肥胖體型、胰島β細胞功能障礙、母系遺傳、伴有聽力下降的糖尿病患者需提高警惕，應(yīng)仔細詢問其伴隨癥狀及家族史，考慮MDM的可能，必要時完善聽力?？茩z測，并盡早完善基因檢測，以便及時確診，規(guī)范治療。tRNA 3243A→G點突變的MDM常表現(xiàn)為聽力障礙，而對于確診的MDM患者應(yīng)早期予以胰島素治療，避免使用雙胍類藥物，基因治療有望成為未來治療MDM的重要手段。應(yīng)盡量動員MDM先證者家系成員篩查血糖、聽力，必要時完善基因檢測，以便早期診斷，改善預(yù)后，同時期待產(chǎn)前診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，從而通過早期干預(yù)而最終改善其結(jié)局。

作者貢獻：胡紅琳、章秋、王祺進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析；張娜娜、黃有燁進行數(shù)據(jù)收集及整理；張娜娜進行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；胡紅琳進行論文的修訂，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。