新型快速流行性感冒病毒抗原檢測方法免疫熒光法在流行性感冒篩查中的應用價值研究

李曉光，陳靜，王偉，李璐，林菲，賈瑩，張碧瑩，胥婕

本研究價值：

免疫熒光法是國內較新的流行性感冒（流感）檢測方法，本研究將其與傳統(tǒng)的快速流感病毒抗原檢測方法免疫滲濾法和膠體金法對比，顯示有一定優(yōu)勢。同時本研究細化年齡分層，發(fā)現(xiàn)隨年齡增長，各檢測方法的靈敏度有下降趨勢，特別是當年齡＞60歲時，膠體金法檢測甲型流感的靈敏度降低到65%，且3種方法對乙型流感的靈敏度僅為58%～67%。提示對于老年人，需要更加警惕快速流感病毒抗原檢測結果的假陽性。

流行性感冒（流感）是常見的呼吸道傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，季節(jié)性流感導致每年5%～10%的成年人、20%～30%的兒童發(fā)病，其中3 000 000～5 000 000例為重癥患者，290 000～650 000例患者死亡［1］。流感疫情傳播快、發(fā)展迅速，建立快速流感病毒抗原檢測方法可為臨床診療提供依據(jù)，避免抗生素濫用，促進抗病毒藥物合理應用，也利于對疫情的監(jiān)測及采取更有效的控制措施。

目前，傳統(tǒng)快速流感病毒抗原檢測方法，如膠體金法，與流感病毒核酸檢測相比，靈敏度偏低，臨床應用受到影響。免疫熒光法流感病毒抗原檢測是一種新型快速流感病毒抗原檢測方法，其基于免疫熒光法，配有自動化讀取儀器，15 min出結果，是一種敏感而快速的流感診斷方法［2-3］，于2019年6月在中國上市。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測流感病毒核酸是常用的確診流感病毒的方法之一。

本研究的目的是對季節(jié)性流感患者進行免疫熒光法檢測，并與傳統(tǒng)快速流感病毒抗原檢測方法和RT-PCR方法進行比較，以探討其在流感篩查、快速診斷中的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 分別于2017年7—12月、2019年1—2月選取北京大學第三醫(yī)院感染疾病科發(fā)熱門診收治的患者472例，其中男209例（44.3%），女263例（55.7%）；年齡16～86歲，平均年齡（37.3±17.5）歲。入選標準：具有發(fā)熱（＞38 ℃）/咳嗽/咽痛癥狀之一，或者近14 d內與發(fā)熱患者密切接觸。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 采集患者鼻咽拭子，放入1 ml病毒保存液，4 ℃保存，2 h內檢測。

1.2.2 檢測方法 RT-PCR由分子生物實驗室有試驗資質的人員完成，其他試驗屬于床旁快速檢測，由臨床醫(yī)生完成。各試驗人員采用盲法分別進行試驗。

1.2.2.1 免疫熒光法 采用購自Quidel Corporation的Sofia流感病毒抗原檢測試劑盒，將260 μl鼻咽拭子樣本加120 μl測試試劑混勻，滴入測試板，靜置15 min，放入自動讀取儀器（簡稱Sofia），讀取結果。

1.2.2.2 免疫滲濾法 采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產的甲型/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒，利用免疫滲濾技術結合雙抗體夾心法檢測甲型/乙型流感病毒抗原：將200 μl樣品加入400 μl裂解液后混勻，加入加樣孔，靜置10 min，加入酶標試劑，靜置2～3 min，洗滌2次，加入顯色劑，靜置2 min，加入終止液，靜置3 min，觀察結果。

1.2.2.3 膠體金法 采用廣州萬孚生物技術有限公司生產的甲型/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒，利用免疫層析技術結合雙抗體夾心法檢測甲型/乙型流感病毒抗原：向測試卡的加樣孔中滴加80 μl溶解有待測樣本的轉運保存液，15～20 min觀察結果。

免疫熒光法、免疫滲濾法與膠體金法的工作原理、操作方法差異詳見表1。

1.2.2.4 RT-PCR方法 采用中國南京碩世生物科技有限公司生產的流感病毒核酸檢測試劑盒，以甲型流感M蛋白基因和乙型流感N蛋白基因編碼區(qū)的保守區(qū)為靶區(qū)域，使用試劑盒自帶的引物和探針在同一反應體系中同時檢測甲型和乙型流感病毒。檢測時加入140 μl鼻咽拭子樣本，進行核酸提取、PCR擴增。以RT-PCR方法為金標準。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（x ±s）表示，計數(shù)資料采用相對數(shù)表示。制作診斷性試驗四格表，進行診斷效能分析。

2 結果

2.1 流感病毒陽性檢出率

2.1.1 免疫熒光法 472例患者中，共檢出甲型/乙型流感262例，總陽性檢出率為55.5%，其中甲型流感169例，陽性檢出率為35.8%；乙型流感93例，陽性檢出率為19.7%。

表1 免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法檢測方法學比較Table 1 Methodological comparison of immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique

2.1.2 免疫滲濾法 472例患者中，共檢出甲型/乙型流感247例，總陽性檢出率為52.3%，其中甲型流感159例，陽性檢出率為33.7%；乙型流感88例，陽性檢出率為18.6%。

2.1.3 膠體金法 472例患者中，共檢出甲型/乙型流感259例，總陽性檢出率為54.9%，其中甲型流感162例，陽性檢出率為34.3%；乙型流感94例，陽性檢出率為19.9%。另有3例同時檢出甲型流感和乙型流感。

2.1.4 RT-PCR 472例患者中，共檢出甲型/乙型流感292例，總陽性檢出率為61.9%，其中甲型流感195例，陽性檢出率為41.3%；乙型流感94例，陽性檢出率為19.9%。另有3例同時檢出甲型流感和乙型流感。

2.2 免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法與RT-PCR方法的檢測結果比較

2.2.1 免疫熒光法與RT-PCR方法的檢測結果比較 對于甲型/乙型流感聯(lián)合檢測，免疫熒光法靈敏度為89.0%（260/292），特異度為98.9%（178/180），陽性預測值為99.2%，陰性預測值為84.8%，陽性似然比為80.1，陰性似然比為0.124，準確度為92.7%（438/472）。

對于甲型流感單獨檢測，免疫熒光法靈敏度為85.4%（169/198），特異度為100.0%（274/274），陽性預測值為100.0%，陰性預測值為90.4%，陰性似然比為0.146，準確度為93.9%（443/472）。

對于乙型流感單獨檢測，免疫熒光法靈敏度為93.8%（91/97），特異度為99.5%（373/375），陽性預測值為97.8%，陰性預測值為98.4%，陽性似然比為175.9，陰性似然比為0.062，準確度為98.3%（464/472）。

2.2.2 免疫滲濾法與RT-PCR方法的檢測結果比較 對于甲型/乙型流感聯(lián)合檢測，免疫滲濾法靈敏度為82.9%（242/292），特異度為97.2%（175/180），陽性預測值為98.0%，陰性預測值為77.8%，陽性似然比為29.8，陰性似然比為0.176，準確度為88.3%（417/472）。

對于甲型流感單獨檢測，免疫滲濾法靈敏度為79.3%（157/198），特異度為99.3%（272/274），陽性預測值為98.7%，陰性預測值為96.9%，陽性似然比為108.6，陰性似然比為0.209，準確度為90.9%（429/472）。

對于乙型流感單獨檢測，免疫滲濾法靈敏度為87.6%（85/97），特異度為99.2%（372/375），陽性預測值為96.6%，陰性預測值為96.9%，陽性似然比為109.5，陰性似然比為0.125，準確度為96.8%（457/472）。

2.2.3 膠體金法與RT-PCR方法的檢測結果比較 對于甲型/乙型流感聯(lián)合檢測，膠體金法靈敏度為84.6%（247/292），特異度為93.3%（168/180），陽性預測值為95.4%，陰性預測值為78.9%，陽性似然比為12.7，陰性似然比為0.165，準確度為87.9%（415/472）。

對于甲型流感單獨檢測，膠體金法靈敏度為79.3%（157/198），特異度為97.1%（266/274），陽性預測值為95.2%，陰性預測值為86.6%，陽性似然比為27.2，陰性似然比為0.213，準確度為89.6%（423/472）。

對于乙型流感單獨檢測，膠體金法靈敏度為89.7%（87/97），特異度為97.3%（365/375），陽性預測值為89.7%，陰性預測值為97.3%，陽性似然比為33.6，陰性似然比為0.106，準確度為95.8%（452/472）。

以RT-PCR方法為金標準，免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法對流感檢測結果的四格表見表2。

2.3 免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法對流感分型檢測結果 根據(jù)RT-PCR方法檢測結果對195例甲型流感進一步進行H1和H3分型，檢測出H1型60例，H3型131例，4例未檢測出分型。對3例同時檢測出甲型流感和乙型流感者再進行甲型流感分型檢測，結果1例為H1型，2例僅測出乙型流感，未測出甲型流感分型。綜上，共檢測出甲型H1型流感61例，甲型H3型流感131例，乙型流感96例。

免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法對不同流感分型檢測結果見表3。

2.4 不同年齡分層免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法檢測流感的靈敏度、特異度比較 按照年齡分層，16～20歲57例（12.1%）、21～40歲277例（58.7%）、41～60歲69例（14.6%）、＞60歲69例（14.6%）。免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法檢測流感的靈敏度、特異度見表4。

3 討論

流感病毒核酸檢測是目前確診流感最重要的手段之一，但其費用較高，耗時長，很多醫(yī)療機構和流感監(jiān)測點尚不具備相應的人員和設備。快速流感病毒抗原檢測方法簡單、快捷，只需在床旁操作，一般醫(yī)務人員可以學習掌握，近年來在流感篩查中得到了廣泛應用。然而，傳統(tǒng)的快速流感病毒抗原檢測方法靈敏度差異很大［4-5］，臨床上需要探索靈敏度更高的流感快速篩查方法。

表2 以RT-PCR方法為金標準，免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法對流感檢測結果（n=472，例）Table 2 Results of influenza virus antigen detection by immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique，with RTPCR as the gold standard

表3 免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法對流感分型符合率〔n（%）〕Table 3 Diagnostic accuracy of immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique for different influenza virus subtypes with RT-PCR as the gold standard

表4 不同年齡分層免疫熒光法、免疫滲濾法、膠體金法檢測流感的靈敏度、特異度（%）Table 4 Detection sensitivity and specificity of immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique for influenza in four age groups

本研究472例患者均采用3種方法檢測，結果顯示免疫熒光法無論是對甲型/乙型流感聯(lián)合檢測，還是甲型流感、乙型流感單獨檢測，靈敏度、特異度均最高，其中靈敏度分別為89.0%、85.4%、93.8%，特異度分別為98.9%、100.0%、99.5%。

免疫熒光法流感病毒檢測系統(tǒng)可以連接VIRENA遠程數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，并且將檢測結果通過網絡上傳至被授權的公共衛(wèi)生管理機構，以達到對流感疫情的實時監(jiān)控［6］。TEMTE等［7］在美國威斯康星州19個初級醫(yī)療機構通過免疫熒光法對流感疫情進行近乎于實時的監(jiān)測，并向公共衛(wèi)生機構無線傳輸，每周統(tǒng)計流感檢測陽性數(shù)據(jù)，通過與RT-PCR方法檢測流感陽性的獨立的監(jiān)測系統(tǒng)進行比較，結果證實免疫熒光法能夠早期監(jiān)測到流感疫情的暴發(fā)，與RT-PCR網絡實驗室的數(shù)據(jù)相匹配。

免疫熒光法與其他快速流感病毒抗原檢測方法對比，診斷準確性具有一定優(yōu)勢。本研究與其他研究結果相似，但本研究的樣本量更大，且覆蓋2個流感季節(jié)。RYU等［8］的研究納入218例患者并比較3種數(shù)字快速流感病毒抗原檢測方法和1種傳統(tǒng)床旁快速流感病毒抗原檢測方法對于甲型流感的檢測效能，結果儀器BUDDI、Sofia、Veritor和膠體金便攜檢測試劑盒Bioline的靈敏度分別是87.7%、94.5%、87.7%和72.6%，特異度分別是100.0%、97.7%、96.5%和100.0%。YANG等［9］的研究納入109例患者，結果顯示Sofia免疫熒光法檢測甲型流感的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為82%、89%、77%和89%?？追裁鳎?0］的研究納入100例流感患者，結果顯示Sofia免疫熒光法陽性檢出率為95%，而膠體金法（用GICA檢測試劑）陽性檢出率僅為62%。楊靜紅等［11］的研究納入168例流感樣患者，結果顯示Sofia免疫熒光法陽性檢出率為17.86%，高于膠體金法（用GICA檢測試劑）的8.93%，若以RT-PCR為金標準，則Sofia免疫熒光法對甲型流感和乙型流感的靈敏度分別為83.3%和71.4%，特異度為100.0%。

免疫熒光法對流感患者明確診斷，指導診療，改善預后均有一定意義。DIALLO等［12］應用Sofia免疫熒光法對238例兒科急診患兒進行檢測，結果陽性組因為得到診斷較明確，后續(xù)生化檢查（20%與56%，P＜10-7）和影像學檢查（23%與52%，P＜10-5）的比例明顯減少，住院率降低（0.8%與9.1%，P=0.009）。

本研究的研究對象可能存在采樣時間偏倚和年齡偏倚。本研究中病原體的陽性檢出率高，免疫熒光法、RT-PCR方法分別為53.1%和59.4%。分析原因：研究對象主要是流感樣病例患者和密切接觸者，采樣時間主要集中在2017年底和2019年初的兩個流感流行季節(jié)，這符合臨床需求，但可能存在時間偏倚。本研究中研究對象年齡介于16～86歲，范圍廣，但仍以青年為主，40歲以下者占70.8%。今后應擴大研究對象納入范圍，以增加老年人、兒童比例。另外本研究中不同年齡組的流感檢測靈敏度隨年齡增長而降低，但特異度沒有明顯降低。今后可改進儀器，通過調整熒光讀取范圍，適當降低特異度而增加對高齡患者流感檢測的靈敏度。

本研究的另一個局限性是金標準的選擇。既往研究常選流感病毒分離、細胞培養(yǎng)作為金標準，但是這些方法陽性檢出率低，現(xiàn)已逐步被快速準確的核酸檢測方法取代。核酸檢測方法過于敏感，本身有假陽性風險，當病毒載量很低時，即使檢出陽性，對臨床的指導意義也需要評估。本研究發(fā)現(xiàn)免疫熒光法對甲型流感H1亞型和H3亞型分型符合率存在差異（91.8%與84.7%）。此前BAAS等［13］研究顯示，免疫熒光法無法檢測出多數(shù)H7N9亞型流感，需要在未來的研究中對免疫熒光法檢測流感亞型的效能進行評估。

目前還有許多關于流感快速檢測方法的新探索，如GARDINER等［14］采用二步法進行呼吸道病毒感染診斷方法的研究，即首先采用免疫熒光法進行篩查，對陰性者，再用一種快速核酸檢測儀器BiofireFilmarray進行檢測，經過測算，可以更精確、快速、節(jié)約成本；劉冬蘭等［15］采用流式細胞儀及直接熒光素標記抗體以檢測鼻咽拭子上皮細胞的流感病毒抗原。

總之，與傳統(tǒng)快速流感抗原檢測方法比較，免疫熒光法在甲型/乙型流感的檢測中表現(xiàn)出更高的靈敏度，在流感篩查中有一定應用前景。建議今后流感樣患者診治過程中先進行免疫熒光法快速篩查，必要時再考慮用快速核酸檢測方法對結果進行驗證，但免疫熒光法尚不能作為治療或其他管理決策的唯一依據(jù)。

作者貢獻：李曉光進行文章的構思與設計，結果的分析與解釋，撰寫論文；李曉光、陳靜進行研究的實施與可行性分析，統(tǒng)計學處理，論文的修訂；陳靜、王偉、李璐、林菲、賈瑩、張碧瑩進行數(shù)據(jù)收集；李曉光、陳靜、王偉、李璐、林菲進行數(shù)據(jù)整理；胥婕負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。