集落刺激因子-1自背根節(jié)向脊髓轉(zhuǎn)運(yùn)在長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛中的作用

付寶軍，姜靜靜，李恒

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院·清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院麻醉科，廣東 清遠(yuǎn) 511518)

長(zhǎng)春新堿是一種常用化療藥物，在治療惡性腫瘤的同時(shí)常?？烧T發(fā)化療所致神經(jīng)病理性疼痛(chemotherapy-induced neuropathic pain，CINP)，CINP會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，不能耐受疼痛的患者會(huì)被迫降低化療藥物的劑量，甚至完全停止治療。目前，對(duì)于化療引起的神經(jīng)性疼痛的治療策略僅限于使用三環(huán)抗抑郁藥、抗驚厥藥和阿片類藥物治療，但這些藥物往往因?yàn)楦鞣N不良反應(yīng)而限制了臨床應(yīng)用[1]。因此，發(fā)現(xiàn)新的CINP發(fā)生機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。隨著對(duì)慢性痛機(jī)制研究的不斷深入，細(xì)胞因子尤其是集落刺激因子-1(colony stimulating factor-1，CSF-1)在神經(jīng)病理性疼痛中的作用越來越受到關(guān)注。近期研究證實(shí)[2-4]：在脊神經(jīng)結(jié)扎、背部疼痛、關(guān)節(jié)炎疼痛模型中，CSF-1對(duì)慢性痛的疼痛信息調(diào)制過程發(fā)揮重要作用，但是其在CINP過程中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究采用長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，探討CSF-1在長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和藥品 注射用硫酸長(zhǎng)春新堿(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，兔抗大鼠CSF-1單克隆抗體和兔抗大鼠離子鈣結(jié)合適配器分子1(ionized calcium binding adapter molecule1，Iba1)單克隆抗體(Abcam公司，美國(guó))，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司，武漢)，von Frey細(xì)絲(Stoelting公司，美國(guó))，Trizol RNA抽提試劑、BeyoR TTM cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和焦碳酸二乙酯(diethyl dicarbonate，DEPC)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司，南通)，PCR引物(北京天根生化科技有限公司合成，北京)。熱痛刺激儀(Stoelting公司，美國(guó))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠(200～230 g)由清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可SYXK(粵)2019-0206]。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與應(yīng)用委員會(huì)批準(zhǔn)，遵守國(guó)際衛(wèi)生學(xué)會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和應(yīng)用指南》[5]。

1.2 方法

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由攝食和飲水，室溫(22±1)℃，光照周期12 h(7∶00～19∶00光照；19∶00～7∶00黑暗)。SD大鼠30只，按隨機(jī)數(shù)表法分為3組：正常對(duì)照組、CINP組和背根切斷(dorsal root rhizotomy，DRR)組，每組10只。CINP組：建立CINP模型，方法為隔日腹腔注射長(zhǎng)春新堿，125 μg/kg，共計(jì)4次，第1次注射當(dāng)天視為第1天。DRR組：切斷腰4～6背根后，建立CINP模型。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 機(jī)械縮足反射閾值 用von Frey纖維絲以u(píng)p-down法推算50%縮足閾值[6]：將一個(gè)有機(jī)玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，大鼠在其中適應(yīng)15 min后，用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時(shí)間≤3 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測(cè)定首先從0.008 g開始，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，給予相鄰大1級(jí)力度的刺激；如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則給予相鄰小1級(jí)力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第1次陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測(cè)定4次。最大力度為15 g，大于此值時(shí)記為15 g，每次刺激間隔為30 s。在給藥前、給藥后第1、3、5、7天采用機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)評(píng)價(jià)大鼠機(jī)械痛敏。

1.3.2 熱縮足反射潛伏期 將有機(jī)玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，采用熱痛刺激儀照射大鼠足底[7]。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。自動(dòng)切斷時(shí)間為20 s，以防止組織損傷。熱刺激強(qiáng)度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中維持一致。每只動(dòng)物測(cè)定5次，每次間隔3 min，取后3次平均值為大鼠TWL。在給藥前、給藥后第1、3、5、7天采用TWL評(píng)價(jià)大鼠熱痛敏。

1.3.3 脊髓和背根節(jié)CSF-1蛋白 給藥后第7天，各組取3只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，斷頭處死，冰上取出脊髓腰膨大及背根節(jié)部位，加入裂解液進(jìn)行勻漿，4℃下12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法進(jìn)行蛋白定量。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為80 V恒壓，分離膠電泳條件為100 V恒壓，當(dāng)溴酚藍(lán)染料前端至分離膠末端時(shí)即停止電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入β-actin(兔抗小鼠，1∶2 000)和CSF-1(兔抗小鼠，1∶1 000)，4℃孵育過夜后用含有吐溫20的Tris緩沖鹽水(tris buffered saline containing Tween 20，TBST)洗膜3次，10 min/次。加入辣根過氧化物酶(horseradish pero-xidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)室溫孵育2 h后TBST洗膜4次，10 min/次。電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯色、曝光和顯影，采用Image J軟件檢測(cè)目的蛋白條帶及β-actin蛋白條帶的光密度值，目標(biāo)蛋白表達(dá)量=目標(biāo)蛋白條帶光密度/β-actin蛋白條帶光密度。

1.3.4 免疫熒光化學(xué)檢測(cè)Iba1蛋白 給藥后第7天，各組取3只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，用4%多聚甲醛灌注固定，取大鼠腰4～6背根節(jié)，4%多聚甲醛后固定2 h，再先后于20%、30%蔗糖溶液中脫水，冰凍切片機(jī)切片，厚度14 μm。免疫熒光染色：磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)(0.01 mol/L，pH值7.4)洗片3次，20 min/次；加5%羊血清室溫封閉2 h；加一抗(Iba1，1∶200)，4℃過夜孵育；次日復(fù)溫至室溫后PBS洗3次，15 min/次；分別加入Cy3標(biāo)記的熒光二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，PSB洗3次，20 min/次，晾干，封片劑封片；置熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.3.5 脊髓和背根節(jié)CSF-1 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定給藥后第7天，每組各取3只大鼠安樂死后進(jìn)行檢查。提取大鼠L4～6脊髓及背根節(jié)總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用ΔΔCT法測(cè)定CSF-1 mRNA含量。CSF-1上游引物：5′-TGCTAAGTGCTCTAGCCGAG-3′；下游引物：5′-CCCCCAACAGTCAGCAAGAC-3′。β-actin上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′；下游引物：5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。計(jì)算CSF-1與β-actin的比值為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠MWT和TWL變化情況

與對(duì)照組相比，腹腔注射長(zhǎng)春新堿3、5、7 d后，CINP組大鼠的MWT[3 d：(11.6±0.5)g；5 d：(9.3±0.8)g；7 d：(7.9±0.5)g]和TWL[3 d：(17.3±0.7)s；5 d：(15.5±0.6)s；7 d：(13.3±1.2)s]均顯著降低(P<0.05)；與CINP組比較，DRR組大鼠在給藥3、5、7 d后的MWT[3 d：(13.2±0.9)g；5 d：(11.9±0.6)g；7 d：(12.7±1.2)g]和TWL[3 d：(18.3±0.8)s；5 d：(18.0±0.7)s；7 d：(17.8±1.0)s]均顯著升高(P<0.01；圖1)。

圖1 各組大鼠MWT和TWL比較Figure 1 Comparison of MWT(A) and TWL(B) in each group (n=10)CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain; DRR: dorsal root rhizotomy; MWT: mechanical withdrawal threshold; TWL: thermal withdrawal latency. Compared with control group, *P<0.05; compared with CINP group, ##P<0.01.

2.2 各組大鼠脊髓和背根節(jié)CSF-1蛋白表達(dá)情況比較

與對(duì)照組相比，CINP組大鼠背根節(jié)[(0.21±0.04)和(1.08±0.15)]和脊髓CSF-1蛋白[(0.22±0.05)和(1.17±0.14)]表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與CINP組相比，DRR組大鼠背根節(jié)CSF-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而脊髓CSF-1蛋白[(1.17±0.14)和(0.45±0.06)]表達(dá)顯著降低(P<0.01；圖2)。

圖2 各組大鼠背根節(jié)和脊髓CSF-1蛋白表達(dá)情況比較Figure 2 Comparison of CSF-1 proteins in dorsal root ganglia(A)and spinal cord(B) between each group (n=3)CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain; CSF-1:colony stimulating factor-1; DRR: dorsal root rhizotomy. Compared with control group,**P<0.01; compared with CINP group, ##P<0.01.

2.3 各組大鼠脊髓Iba1蛋白表達(dá)情況比較

與對(duì)照組相比，CINP組大鼠脊髓Iba1蛋白表達(dá)[(100±0)% 和(250±19)%]顯著升高(P<0.01)，與CINP組相比，DRR組大鼠脊髓Iba1蛋白表達(dá)[(250±19)% 和(130±16)%]顯著降低(P<0.05；圖3)。

圖3 各組大鼠脊髓Iba1表達(dá)情況比較Figure 3 Comparison of Iba1 in spinal cord in each group (n=3)A: immunofluorescence staining(×50); B: quantitative analysis. CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain;CSF-1: colony stimulating factor-1; Iba1: ionized calcium binding adapter molecule 1; DRR: dorsal root rhizotomy.Compared with control group, **P<0.01; compared with CINP group, #P<0.05.

2.4 各組大鼠背根節(jié)和脊髓CSF-1 mRNA表達(dá)情況比較

與對(duì)照組相比，CINP組背根節(jié)CSF-1 mRNA表達(dá)[(0.20±0.05)和(1.02±0.10)]顯著升高(P<0.01)；與CINP組相比，DRR組背根節(jié)CSF-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠脊髓CSF-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖4)。

圖4 各組大鼠背根節(jié)和脊髓CSF-1 mRNA表達(dá)情況比較Figure 4 Comparison of CSF-1 mRNA in dorsal root ganglia)(A)and spinal cord(B) in each group (n=3)CINP: chemotherapy-induced neuropathic pain; CSF-1: colony stimulating factor-1; DRR: dorsal root rhizotomy. Compared with control group,**P<0.01.

3 討 論

CINP大鼠模型的可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好，且與臨床CINP特征有很多相似之處，已廣泛應(yīng)用于CINP的研究[8]。本研究結(jié)果表明，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠MWT和TWL開始逐漸降低，表明CINP模型制備成功。

CINP的機(jī)制至今尚不完全清楚，因而缺乏有效的治療方法。闡明CINP的發(fā)生機(jī)制，開發(fā)和尋找針對(duì)機(jī)制的新藥及治療手段具有重大意義。CSF-1是一種細(xì)胞因子，通過與Ⅲ型受體酪氨酸激酶偶聯(lián)CSF-1受體結(jié)合來發(fā)揮作用，在調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的存活、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。研究表明[1]，背根節(jié)初級(jí)感覺神經(jīng)元中CSF-1的上調(diào)對(duì)脊神經(jīng)結(jié)扎動(dòng)物脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及促傷害性基因誘導(dǎo)起著重要作用。目前尚不清楚CSF-1是否在長(zhǎng)春新堿致神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果表明，CINP大鼠產(chǎn)生痛覺過敏的同時(shí)伴有背根節(jié)CSF-1蛋白、Csf-1mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，提示背根節(jié)CSF-1蛋白參與了CINP形成，這與Zhou等[9]報(bào)道結(jié)果一致。有趣的是，脊髓CSF-1蛋白上調(diào)，但是脊髓Csf-1 mRNA表達(dá)卻與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示脊髓CSF-1蛋白上調(diào)可能是由于其他部位CSF-1蛋白向脊髓轉(zhuǎn)運(yùn)。為了驗(yàn)證該假設(shè)，我們將大鼠背根切斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，背根節(jié)CSF-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，但脊髓CSF-1蛋白表達(dá)明顯降低，因此提示在CINP發(fā)生的過程中，背根節(jié)原發(fā)產(chǎn)生的CSF-1蛋白經(jīng)外周端向脊髓傳遞，增加CSF-1向脊髓傳遞痛覺信息。研究表明[2]，周圍神經(jīng)損傷增加了初級(jí)感覺神經(jīng)元產(chǎn)生和釋放CSF-1，CSF-1向脊髓運(yùn)輸，從而調(diào)節(jié)背角小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，促發(fā)外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛。本研究結(jié)果表明，與CINP組比較，背根切斷后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1的表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)背根節(jié)原發(fā)產(chǎn)生的CSF-1蛋白經(jīng)外周端向脊髓傳遞，引起脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的活化增殖，從而誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛，與上述研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，CSF-1蛋白源發(fā)于背根節(jié)，但Tang等[10]研究表明，CSF-1蛋白源發(fā)于脊髓背角，這種結(jié)果差異可能與研究中使用的動(dòng)物模型不同、觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)不同、動(dòng)物種屬不同等因素有關(guān)。

總之，長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛可能與CSF-1自背根節(jié)向脊髓轉(zhuǎn)運(yùn)活化小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。