HPLC法快速定量測(cè)定硫酸長(zhǎng)春新堿

袁 琦， 徐 玫， 趙 輝， 楊 浩

(河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475004)

長(zhǎng)春花為夾竹桃科植物長(zhǎng)春花Catharanthus roseus的全草，迄今從中已經(jīng)分離出70余種生物堿，其中對(duì)長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿的應(yīng)用最為廣泛［1］。長(zhǎng)春新堿是二聚吲哚類化合物，主要存在于長(zhǎng)春花葉中，是臨床常用的一種廣譜抗腫瘤藥，主要用于治療急性淋巴細(xì)胞性白血病、霍奇金病和惡性淋巴瘤等［2］。

長(zhǎng)春新堿為白色粉末，具有引濕性，遇光或熱易變黃，2010年版《中國(guó)藥典》(二部)用紫外分光光度法測(cè)定注射用硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑［3］。目前隨著各種新劑型的不斷出現(xiàn)，其所用輔料的不斷變化，可能會(huì)對(duì)紫外分光光度法定量測(cè)定造成一定的干擾。而高效液相法由于其分離效能高，靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，可用于硫酸長(zhǎng)春新堿類制劑的定量測(cè)定［4-10］。本實(shí)驗(yàn)研究了利用高效液相色譜法測(cè)定注射用硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑的條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters—e2695高效液相色譜儀 (Waters公司)，Waters—2489可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器 (Waters公司)，UV—1600型紫外可見分光光度計(jì) (北京瑞利)，BP—211D電子天平 (德國(guó)Sartorius)。

1.2 試劑及樣品 甲醇為色譜純，水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純。粉針劑硫酸長(zhǎng)春新堿 (廣東嶺南制藥有限公司);硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度97.5%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品1.024 4 mg，加流動(dòng)相定量稀釋至5.0 mL，搖勻，作為對(duì)照品溶液，用前新鮮配制。

2.1.2 供試品溶液的制備 取硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑1瓶，精密稱定，加流動(dòng)相1 mL溶解轉(zhuǎn)入5 mL量瓶，并用流動(dòng)相多次洗滌容器，洗液并入量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，既得。

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取一定質(zhì)量濃度的硫酸長(zhǎng)春新堿標(biāo)準(zhǔn)溶液 (溶劑為流動(dòng)相)，以流動(dòng)相作為參比，于190～340 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。由紫外圖可知，硫酸長(zhǎng)春新堿在220 nm、240 nm和297 nm波長(zhǎng)有三個(gè)吸收峰［11］。為了避開干擾峰的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇297nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 色譜條件 以Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，甲醇-乙腈-0.5%三乙胺水溶液 (20∶20∶60，以冰醋酸調(diào)節(jié)pH=3)為流動(dòng)相，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 297 nm，進(jìn)樣量 20 μL，柱溫25℃。

2.2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，得圖1。由圖1可知，硫酸長(zhǎng)春新堿能夠完全分離，無(wú)相鄰色譜峰干擾，峰形良好，理論塔板數(shù)按硫酸長(zhǎng)春新堿色譜峰計(jì)算不低于5 000。

圖1 硫酸長(zhǎng)春新堿溶液的色譜圖

2.3 方法考察

2.3.1 精密度 吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD為0.05%。

2.3.2 重復(fù)性 取同一批次硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑 (批號(hào)090803)，按2.1.2項(xiàng)下制備供試品溶液6份，進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算，硫酸長(zhǎng)春新堿測(cè)定結(jié)果的RSD為0.08%。

2.3.3 穩(wěn)定性 按2.1.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別于溶解后10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h進(jìn)樣，測(cè)定硫酸長(zhǎng)春新堿的峰面積，其結(jié)果見表1。

由結(jié)果可知，藥品在前4 h，峰面積逐漸減小，4 h后趨于平穩(wěn)。說(shuō)明硫酸長(zhǎng)春新堿溶液不穩(wěn)定，易發(fā)生變化。但在前30 min，峰面積變化較小，即硫酸長(zhǎng)春新堿溶液在最初的30 min基本穩(wěn)定，可用于定量測(cè)定。

表1 藥品穩(wěn)定性

2.3.4 線性范圍 精密稱取硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品1.994 4 mg，加甲醇定量溶解，配制成 398.88、299.16、199.44、99.72、49.86 μg/mL的溶液，各取20 μL進(jìn)樣。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以溶液中硫酸長(zhǎng)春新堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，回歸方程為Y=2.300 6X+2.385 7，R2=0.998 2。結(jié)果表明，硫酸長(zhǎng)春新堿在49.86～398.88 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取9個(gè)10 mL量瓶中，分別精密加入已知質(zhì)量濃度供試品溶液4.0 mL，再分別加入3.0、4.0、5.0 mL對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備低、中、高3種質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3份樣品。按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸長(zhǎng)春新堿的平均回收率為101.28%，RSD為0.471%，本法具有良好的回收率。

2.4 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑，每批取3份，按2.1.2項(xiàng)下方法制得供試液，每份樣品進(jìn)樣2次，測(cè)得的峰面積代入回歸方程計(jì)算，結(jié)果見表3。

表2 樣品回收率實(shí)驗(yàn)

表3 硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑的測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 穩(wěn)定性 圖2為長(zhǎng)春新堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖，由圖可知，長(zhǎng)春新堿分子中具有3個(gè)酯鍵，在溶液中受到氫鍵作用，易發(fā)生解離，所以長(zhǎng)春新堿的穩(wěn)定性較差，為了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)選擇較快速的測(cè)定方法，如《中國(guó)藥典》采用UV法測(cè)定硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑的量［3］。通過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在溶液配制最初的30 min內(nèi)，峰面積隨時(shí)間變化較小，隨后變化逐漸增大。推斷可能是由于氫鍵對(duì)酯鍵的破壞是需要一定的能量累積，所以在最初的30 min內(nèi)長(zhǎng)春新堿基本無(wú)變化。為了證實(shí)這一推斷，又考察了硫酸長(zhǎng)春新堿溶液在220 nm處的穩(wěn)定性，得圖3。由圖3可以明顯發(fā)現(xiàn)，在最初階段，基本無(wú)分解產(chǎn)物的色譜峰，隨時(shí)間延長(zhǎng)，分解產(chǎn)物的色譜峰逐漸增大，與本實(shí)驗(yàn)的推斷相符。而到4 h基本穩(wěn)定時(shí)，分解產(chǎn)物總的峰面積與硫酸長(zhǎng)春新堿的峰面積比為3.3%，未超出《中國(guó)藥典》中規(guī)定5%的雜質(zhì)最大允許量［3］，說(shuō)明氫鍵對(duì)酯鍵的解離作用，不影響硫酸長(zhǎng)春新堿粉針劑的用藥安全性。

圖2 長(zhǎng)春新堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖3 硫酸長(zhǎng)春新堿溶液在220 nm的色譜圖

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品的紫外吸收光譜可知，硫酸長(zhǎng)春新堿在220 nm、240 nm和297 nm波長(zhǎng)處有3個(gè)吸收峰，其中220 nm處吸收峰最大。分別以這3個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)樣測(cè)定。發(fā)現(xiàn)以297 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，樣品基本無(wú)干擾峰，說(shuō)明干擾組分在297 nm無(wú)吸收，所以選擇297 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道中利用HPLC法測(cè)定硫酸長(zhǎng)春新堿，流動(dòng)相多采用甲醇-磷酸鹽系統(tǒng)［12-13］。由于硫酸長(zhǎng)春新堿分子中含有4個(gè)N雜環(huán)，具有較強(qiáng)的堿性，易產(chǎn)生拖尾。在選擇流動(dòng)相時(shí)，分別考查了不同的流動(dòng)相，以0.04 mol/L磷酸緩沖液-甲醇 (60∶40，pH=3)和0.5%三乙胺-甲醇 (60∶40，冰醋酸調(diào)pH為3)為流動(dòng)相，硫酸長(zhǎng)春新堿色譜峰均有不同程度的拖尾，故采用0.5%三乙胺-甲醇-乙腈 (60∶20∶20，冰醋酸調(diào)pH為3)為流動(dòng)相。

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