多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝及化學(xué)成分研究

雷林潔， 滕 亮，， 趙 欣， 于富生， 王長虹

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，新疆 烏魯木齊830011;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

阿魏為傘形科阿魏屬植物新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen或阜康阿魏Ferula fukanensisK.H.Shen的樹脂。主要分布于地中海、中亞及其鄰邊地區(qū)。我國約有26種1變種，主產(chǎn)于新疆。阿魏藥材是從阿魏屬植物的根或莖中得到的一種油膠樹脂。阿魏性苦、辛，溫。歸腎、胃經(jīng)，具有殺滅血吸蟲［1］、鎮(zhèn)痛和戒斷的抑制作用［2］、抗?jié)儯?］、抗過敏［4］、抗菌作用［5］、抗炎作用［6］等功效。阿魏的化學(xué)成分主要是樹脂、樹膠、揮發(fā)油、多糖等，其中含揮發(fā)油約10% ～17%，樹脂約40% ～64%，樹膠約25%［7］。阿魏有香阿魏、臭阿魏之分，臭阿魏主要包含新疆阿魏、阜康阿魏與五彩阿魏。其他阿魏多為香阿魏，主要分布在烏恰、裕民、米泉、木壘、奇臺、石河子等地。上世紀(jì)70年代后，新疆阿魏和阜康阿魏被破壞的相當(dāng)嚴(yán)重，目前阜康阿魏已滅絕，全疆目前僅在拜什墩山區(qū)還有少量的野生新疆阿魏。香阿魏為傘形科植物多傘阿魏Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov的樹脂或根，在新疆資源分布廣泛，在維吾爾、哈薩克等民族中常代替臭阿魏入藥。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了多傘阿魏揮發(fā)油的提取工藝，采用GC-MS對其揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行了分析，并考察提取時間對阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分的影響，為多傘阿魏的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣相色譜儀 (GC-2010 Plus，日本島津);氣質(zhì)聯(lián)用儀 (Agilent 7890 A-5975C型，美國);電子天平 (BS110S，北京賽多利斯天平有限公司);智能恒溫電熱套 (DRT-SX型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥 多傘阿魏 (產(chǎn)地新疆奇臺縣，20111001，由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司于富生主任藥師鑒定為多傘阿魏根的樹脂);乙酸乙酯(天津市化學(xué)試劑一廠，20010408);甲醇 (天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，20110916);丙酮 (天津永晟精細(xì)化工有限公司，20111020);無水硫酸鈉 (天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠，050810)，以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝的研究［18］

2.1.1 考察指標(biāo) 以阿魏油提取率為指標(biāo)對阿魏揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行研究。

2.1.2 多傘阿魏揮發(fā)油相對密度測定 將多傘阿魏揮發(fā)油按照2010年版《中國藥典》一部附錄XD“密度測定法”中的“比重瓶法”進(jìn)行測定，計算揮發(fā)油密度，測定多傘阿魏揮發(fā)油平均密度為0.886 4 g/mL，RSD為0.001%(n=3)。

2.1.3 均勻試驗(yàn)優(yōu)選阿魏揮發(fā)油最佳提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以阿魏揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，采用U7(72)均勻試驗(yàn)設(shè)計，考察溶劑倍數(shù)和提取時間對提取率的影響，因素水平見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Table of levels and factors

將試驗(yàn)結(jié)果采用均勻設(shè)計回歸分析及優(yōu)化系統(tǒng)(UROS)進(jìn)行處理，得回歸方程:Y=2.187 1+1.868 6X1－0.082 6X2－0.206 7X12+0.035 7X1X2。回歸方程顯著性檢驗(yàn)的F=96.683，復(fù)相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9(P＜0.05)。

表2 U7(72)均勻試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果Tab.2 Arrangement and the results of U7(72)uniform design

優(yōu)化條件為:X1(提取時間)=5.71 h;X2(加水量)=13.84倍，理論最大預(yù)測值為7.80%，預(yù)測區(qū)間為7.36%～8.24%。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別稱取3份阿魏50 g，加入14倍水，提取5.5 h，冷卻，計算提取率。

結(jié)果平均揮發(fā)油提取率為7.77%，RSD為0.34%，說明多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝 (工藝Ⅰ)穩(wěn)定、合理、可行。

2.2 多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分的研究

2.2.1 多傘阿魏揮發(fā)油氣相質(zhì)譜分析

2.2.1.1 樣品制備方法 稱取多傘阿魏50 g，加入14倍蒸餾水，提取5.5 h，冷卻，收集揮發(fā)油，采用無水硫酸鈉干燥，得淡黃色揮發(fā)油，備用。分別精密量取各份樣品揮發(fā)油1 mL，置10 mL量瓶中，丙酮定容至刻度，即得。

2.2.1.2 氣相色譜質(zhì)譜分析條件［9-13］氣相色譜條件:氣質(zhì)聯(lián)用儀 (Agilent 7890 A-5975C型，美國);HP-5MS毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氮?dú)?載氣流量為 1 mL/min;進(jìn)樣量0.5 μL;分流比30∶1;進(jìn)樣器250℃;檢測器250℃;升溫程序?yàn)槠鹗紲囟葹?0℃，保持2 min，以2℃/min的速率程序升溫至80℃，保持5 min，最后以4℃/min升溫至180℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件:電離方式EI;電離能量70 eV;離子源發(fā)生器溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍30～350 amu。

2.2.1.3 氣相色譜質(zhì)譜分析結(jié)果 阿魏揮發(fā)油的氣相色譜圖見圖1，總離子流圖見圖2。采用面積歸一化法計算出各組分的相對百分含有量，經(jīng)CAS數(shù)據(jù)庫檢索，確定了多傘阿魏揮發(fā)油的基本化學(xué)成分，共鑒定出44種化合物，其中主要成分為(1R)-(+)-蒎烯 (3.64%)、莰烯 (4.68%)、β-蒎烯 (2.28%)、3-蒈烯 (4.15%)、D-檸檬烯(9.08%)、異松油烯 (3.00%)、(1S，2S，4R)-醋酸-1，3，3-三 甲 基-雙 環(huán) ［2.2.1］庚 烯-2-醇(3.13%)、左旋乙酸冰片酯 (17.78%)、 (E)-β-金合歡烯 (11.26%)、α-法尼烯 (7.48%)、反式-橙花叔醇 (6.33%)、愈創(chuàng)木醇 (11.44%)，未檢出多硫化合物。分析鑒定結(jié)果見表3。

圖1 多傘阿魏揮發(fā)油氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

圖2 多傘阿魏揮發(fā)油總離子流圖Fig.2 TIC of volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

2.3 提取時間對多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)組成的影響［14］

2.3.1 氣相色譜條件 氣相色譜儀 (GC-2010 Plus，日本島津);HP-5MS毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氮?dú)?載氣流量為1 mL/min;進(jìn)樣量0.5 μL;分流比50∶1;總流量54.0 mL/min;壓力80.9 kPa;進(jìn)樣口溫度250℃;升溫程序?yàn)槠鹗紲囟葹?0℃，保持2 min，以4℃/min的速率程序升溫至80℃，保持5 min，以4℃/min的速率程序升溫至180℃，保持5 min，最后以4℃/min的速率程序升溫至200℃。

2.3.2 揮發(fā)油樣品制備 稱取多傘阿魏8份，每份50 g，加入14倍蒸餾水，提取時間分別為1、2、3、4、5、6、7、8 h，冷卻，收集揮發(fā)油，采用無水硫酸鈉干燥，備用。

2.3.3 氣相色譜分析結(jié)果 分別進(jìn)樣2.3.2項(xiàng)樣品0.5 μL，1 h樣品氣相色譜圖見圖3。以提取1 h揮發(fā)油色譜為參比色譜，采用Excel2003軟件計算不同提取時間揮發(fā)油的色譜行為與提取1 h揮發(fā)油色譜行為的相似性［15］，結(jié)果見表4。進(jìn)一步對氣相色譜中主成分色譜峰峰面積變化進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4～圖6。

圖3 提取1 h揮發(fā)油樣品氣相色譜圖Fig.3 GC chromatogram of volatile oil extracted at 1 h

圖4 不同提取時間對成分1～7的峰面積的影響Fig.4 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area of compounds 1-7 in volatile oil

圖5 不同提取時間對成分8～9的峰面積的影響Fig.5 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area of compounds 8-9 in volatile oil

由圖4～6可知，多傘阿魏揮發(fā)油色譜中化學(xué)成分1～7對熱不穩(wěn)定，成分8～9為對熱較穩(wěn)定揮發(fā)性成分，而提取時間的延長則有利于主成分10～12的提取。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 提取時間對多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)組成的影響研究表明，提取時間超過5 h揮發(fā)油化學(xué)組成種類減少，因此根據(jù)工藝Ⅰ的條件設(shè)計單因素實(shí)驗(yàn)，考察提取時間為4 h時不同加水量對提取率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得揮發(fā)油優(yōu)選提取條件 (工藝Ⅱ)，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表3 多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果Tab.3 Constituents and its percentage contents in volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

表4 不同提取時間多傘阿魏油化學(xué)成分色譜相似度評價Tab.4 Evaluation of similarity of the GC chromatogram of volatile oil extracted at different time

圖6 不同提取時間對成分10～12的峰面積的影響Fig.6 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area ofcompounds10-12 in volatile oil

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)Tab.5 Results of validation test(n=3)

上述結(jié)果表明優(yōu)選提取條件 (工藝Ⅱ)為加入藥材14倍水，提取4 h，揮發(fā)油平均提取率為8.02%，RSD為0.09%，說明多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。

與工藝Ⅰ的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (平均揮發(fā)油提取率為7.77%，RSD為0.34%)相比較，兩種提取條件所得揮發(fā)油的提取率相近。但是根據(jù)提取時間對揮發(fā)油化學(xué)組成影響的研結(jié)果可知提取時間超過5 h揮發(fā)油化學(xué)組成種類減少，說明工藝Ⅱ不僅能確保揮發(fā)油的量，同時也能確保揮發(fā)油化學(xué)組成的穩(wěn)定性，因此工藝Ⅱ是更為理想的多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝條件。

3 討論

3.1 多傘阿魏的前處理 多傘阿魏呈脂膏狀，黏稠，具持久的臭味，不易稱取。冷凍干燥、減壓干燥均不易除去其水分。為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，便于物料稱量，在提取前將阿魏樹脂于－18℃冷凍24 h，藥材成塊狀，韌性下降，脆度增加，此時則極易粉碎。

3.2 GC-MS測定多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分 文獻(xiàn)調(diào)研表明新疆阿魏揮發(fā)油因含多硫化合物而具蒜臭味［10］，而多傘阿魏揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果表明鑒定出的44種化合物中不含多硫化合物，與提取物無蒜臭氣味相一致。鑒定出的化合物成分組成及主要成分的百分含有量與文獻(xiàn)報道的香阿魏化學(xué)成分［16-19］不完全一致，這可能與產(chǎn)地、采期、測試儀器的條件有關(guān)。鑒定出的化合物中主要成分為單萜及倍半萜類衍生物，該類化合物多具有消炎抗菌及解痙鎮(zhèn)痛作用［7］，這有可能是多傘阿魏在民間藥用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

3.3 多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分隨著提取時間的動態(tài)變化 本實(shí)驗(yàn)借鑒指紋圖譜相似度評價的方法，以提取1 h的揮發(fā)油色譜圖作為參比色譜，利用簡便易行的Excel 2003軟件進(jìn)行樣品氣相色譜峰的相似度計算，結(jié)果表明揮發(fā)油提取時間不宜超過5 h。當(dāng)揮發(fā)油提取時間超過5 h，無論是相關(guān)系數(shù)還是余弦夾角均出現(xiàn)較為明顯的下降。進(jìn)一步分析提取時間對氣相色譜主成分色譜峰峰面積的影響，結(jié)果提示12個主成分中成分1～7為對熱不穩(wěn)定揮發(fā)性成分，隨著提取時間的延長含有量有下降的趨勢，成分8～9為對熱較穩(wěn)定揮發(fā)性成分，提取時間的變化對含有量影響不是很明顯，而提取時間的延長則有利于成分10～12的提取，可能是因?yàn)檫@類成分對熱穩(wěn)定、分子量大、沸點(diǎn)高、氣化蒸發(fā)所需能量較大的緣故。以上分析提示在揮發(fā)油提取工藝研究中除了關(guān)注揮發(fā)油的提取量外，還需關(guān)注揮發(fā)油質(zhì)的變化，即提取時間對揮發(fā)性成分化學(xué)穩(wěn)定性的影響。

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