雙波長薄層掃描法定量測定二至丸中齊墩果酸與熊果酸

胡俊明， 蔣曉煌， 蔣孟良*

(1．湖南省平江縣大坪鄉(xiāng)衛(wèi)生院，湖南平江414509;2．湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208)

二至丸始載明代《醫(yī)便》，由女貞子和墨旱蓮等量配伍組成。具有補(bǔ)益肝腎，滋陰止血。用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，咽干鼻燥，腰膝酸痛，月經(jīng)量多［1］?，F(xiàn)代研究表明二至丸具有保肝降酶、滋陰、抗骨質(zhì)疏松等多種生物活性［2-6］?！吨袊幍洹?005年版與2010年版一部所載二至丸均是用雙波長掃描法測定其中齊墩果酸量，因女貞子中既含有齊墩果酸，又含有熊果酸，二者為同分異構(gòu)體［7］，在此條件下不能將其二者分離進(jìn)行薄層定量。故《中國藥典》方法實際上測得的是齊墩果酸與熊果酸二者含有量之和。經(jīng)采用嚴(yán)氏方法［8］，將點樣后的薄層板預(yù)處理，再展開測定，其測得結(jié)果準(zhǔn)確，簡單快捷，可更好、更準(zhǔn)確地控制二至丸的內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 實驗材料

1.1 儀器 日本島津CS—930型雙波長薄層掃描分析儀;AB135S型電子分析天平 (分度值0.000 01 g)(梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司);DK—S22型電熱恒溫水浴鍋 (上海精宏實驗設(shè)備有限公司);WGL—65(B)型電熱鼓風(fēng)干燥箱 (天津市泰斯特儀器有限公司);10μL微量進(jìn)樣器 (平頭，上海安亭微量進(jìn)樣器廠)。

1.2 試劑 齊墩果酸與熊果酸對照品，中國藥品生物制品檢定所 (批號分別為110709-200905、110742-200810);硅膠G薄層板 (10 cm×20 cm):德國默克集團(tuán) (Merck KGaA);環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、冰乙酸、碘、硫酸、乙醇等均為分析純。

1.3 藥品 二至丸［1］由江西仁豐藥業(yè)有限公司提供，批號:20101203、20110902、20110903。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃恒定質(zhì)量的齊墩果酸與熊果酸對照品25.50 mg與12.25 mg，分別置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含齊墩果酸1.02 mg/mL、含熊果酸0.49 mg/mL的兩種溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置250 mL索氏提取器中，加乙酸乙酯約60 mL，加熱回流提取6 h，提取液回收乙酸乙酯至干，殘渣加乙酸乙酯使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 空白溶液的制備 取除去女貞子的二至丸研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，同供試品溶液的制備方法制備，得空白對照溶液。

2.4 預(yù)處理、層析及測定 精密吸取供試品溶液2μL、對照品溶液1μL與4μL(疊加點樣，先點一種，點完后再點另一種)，分別交叉點于同一硅膠G薄層板上，將薄層板點樣的一端浸入1%碘-二氯甲烷溶液中約12～15 mm，使溶液沒過斑點迅速取出，立即覆以一玻璃板，30 min后取下玻璃板，熱風(fēng)吹2～3 min，揮去薄層板上殘留的溶液。以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰乙酸 (20∶5∶8∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點清晰，取出，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用透明膠固定，照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB薄層掃描法)進(jìn)行掃描，波長λs=530 nm，λR=700 nm，測量供試品吸光度積分值與對照品吸光度積分值，外標(biāo)兩點法計算，即得。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取上述齊墩果酸與熊果酸對照品溶液各1、2、4、6、8、10μL，分別點于薄層板上，按上述2.4項方法測定吸光度積分值，以齊墩果酸與熊果酸進(jìn)樣量為自變量 (X)，峰面積積分值為因變量 (Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y齊墩果酸=1 120.1X+271.29，r=0.998 5;Y熊果酸=1 085.1X+71.034，r=0.998 2。

實驗表明，齊墩果酸與熊果酸在1.02～10.2μg與0.49～4.9μg范圍內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密吸取齊墩果酸與熊果酸對照品溶液4μL，分別點于2塊薄層板上，各點6份，同上述2.4項進(jìn)行測定，結(jié)果齊墩果酸與熊果酸的RSD分別為1.87%與2.09%，表明儀器精密度良好。

2.7 空白試驗 (陰性干擾試驗) 精密吸取供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液、熊果酸對照品溶液與空白對照溶液各2μL，分別點于同一塊薄層板上，同上述2.4項方法展開、顯色，結(jié)果，空白對照無齊墩果酸和熊果酸斑點，故陰性無干擾，見圖1。

圖1 二至丸薄層色譜圖

2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取樣品供試液2μL按上述方法于0、10、20、40、60 min測定，結(jié)果，齊墩果酸與熊果酸峰面積RSD分別為1.64%與1.72%。結(jié)果表明樣品60 min內(nèi)測定穩(wěn)定。但文獻(xiàn)認(rèn)為顯色后30 min測定較好［8］。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批二至丸樣品5份，按上述方法進(jìn)行提取、展開、顯色、測定，齊墩果酸與熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為10.30 mg/g與5.17 mg/g，RSD分別為1.53%與1.86%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗 取已知含有量 (含齊墩果酸10.06 mg/g、熊果酸5.00 mg/g)的二至丸樣品研細(xì)，精密稱定0.25 g，精密加入1.02 mg/mL齊墩果酸與0.49 mg/mL熊果酸對照品溶液各2.5 mL，同供試品液的制備方法制備樣品供試液，平行6份，按上述方法測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 齊墩果酸與熊果酸加樣回收試驗結(jié)果

2.11 樣品測定 取二至丸3批，按照上述方法制備樣品供試液，同法測定，結(jié)果見表2。

表2 二至丸樣品測定結(jié)果 (n=3，±s)

表2 二至丸樣品測定結(jié)果 (n=3，±s)

批號 取樣量/g齊墩果酸/(mg·g－1)熊果酸/(mg·g－1)20101203 0.506 2 11.00±0.55 5.30±0.28 20110902 0.500 7 10.57±0.38 5.27±0.32 20110903 0.501 6 10.62±0.46 5.46±0.36均數(shù) 10.73 5.34 RSD/%2.19 1.91

根據(jù)上述3批樣品測定結(jié)果，所測二至丸中齊墩果酸的量符合《中國藥典》不得少于8.0 mg的規(guī)定。

3 討論與小結(jié)

本測定方法基本參照《中國藥典》2010年版一部二至丸項下齊墩果酸的含量測定方法，因其不能將齊墩果酸與熊果酸分離，故測定結(jié)果不準(zhǔn)確，經(jīng)改進(jìn)采用嚴(yán)華等人的方法［8］預(yù)處理后可將二者分離，使測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

1%碘-二氯甲烷溶液浸泡立即取出后，應(yīng)用玻璃板覆蓋30 min以上;預(yù)處理后，用《中國藥典》環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯 (5∶2∶1)為展開劑也行，但是，嚴(yán)華等報道的展開劑分離效果更好，Rf值更適當(dāng)。噴10% 硫酸乙醇溶液110℃烘至顯色清晰后，應(yīng)立即用等大的玻璃板覆蓋，周圍并用透明膠封嚴(yán)，以免斑點氧化褪色。

齊墩果酸與熊果酸的定量測定方法采用HPLC法的也很多［9-10］，但因其為末端吸收，而測定時間長、成本高、速度慢，而TLCS法解決了過這些問題，可以在同一塊薄層板上同時測定多個樣品，且速度快。

本品中除女貞子含齊墩果酸外，墨旱蓮也有［11-12］，但該制劑墨旱蓮為水提取，故墨旱蓮中并沒有檢測到齊墩果酸。齊墩果酸為植物藥中廣泛存在的成分，要顯示其特異性，建議《中國藥典》下一版，二至丸含量測定項下改為測定女貞子苷。

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