血站實(shí)驗(yàn)室溶血、脂血比色卡的建立及探討

韓曉燕，馮 旭，許苗苗，張麥利，李 敏

陜西省渭南市中心血站檢驗(yàn)科，陜西渭南 714000

溶血、脂血是血站實(shí)驗(yàn)室最常見的標(biāo)本狀態(tài)，有文獻(xiàn)報(bào)道輕中度溶血、脂血標(biāo)本對ALT[1]、乙型肝炎病毒表面抗原[2-3]、丙型肝炎病毒抗體[4]、人類免疫缺陷病毒抗原抗體[5]、核酸檢測[6]等項(xiàng)目的檢測結(jié)果均無影響，重度溶血、脂血標(biāo)本可導(dǎo)致人類免疫缺陷病毒抗體[5]、梅毒螺旋體抗體[7]的檢測出現(xiàn)假陽性；但不同水平梯度溶血、脂血標(biāo)本影響血站實(shí)驗(yàn)室開展項(xiàng)目的系統(tǒng)性研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室基于：(1)核酸檢測具有靈敏度高、抗干擾能力弱等特點(diǎn)[8-9]；(2)核酸標(biāo)本接收時(shí)已離心，目測檢查的可操作性強(qiáng)；(3)ELISA檢測至少有一次洗板過程，溶血、脂血標(biāo)本已被洗去，不會影響結(jié)果讀取[2,10]等原因，選擇核酸檢測項(xiàng)目來驗(yàn)證溶血、脂血標(biāo)本對血站實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目的影響情況，并依據(jù)該情況制作溶血、脂血目測比色卡，作為標(biāo)本接收時(shí)的依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 50 IU/mL HBV DNA(批號：201909008)、200 IU/mL HCV RNA(批號：201907007)、1 000 IU/mL HIV-1 RNA(批號：201908007)和陰性質(zhì)控品(批號：201907006)均購于北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司；中鏈三酰甘油(批號：16308LNLCL，原產(chǎn)國：印度尼西亞)；溶血標(biāo)本(自制)，核酸檢測陰性的無償獻(xiàn)血者血漿。

1.2試劑、儀器與耗材

1.2.1核酸檢測試劑 Roche TaqScreen MPX Test version 2.0試劑(批號：E31914)，所用試劑嚴(yán)格按照試劑說明書要求進(jìn)行操作。

1.2.2儀器與耗材 瑞士Roche Cobas s201全自動核酸檢測系統(tǒng)，包括Hamilton Microlab Star全自動混樣儀，Cobas Amplipre核酸提取儀及Cobas Taqman核酸擴(kuò)增儀；旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品，型號：XH-B型)；血球計(jì)數(shù)儀(希森美康，型號：KX-21)；生物安全柜(蘇凈安泰，BHC-1300)；可調(diào)式移液器(北京大龍，型號：100～1 000 μL)；核酸負(fù)壓管(碧迪醫(yī)療器械，批號：9184731)。

1.3方法

1.3.1溶血、脂血及陽性項(xiàng)目濃度的選擇 依據(jù)《臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本溶血檢測與應(yīng)用專家共識(征求意見稿)》、Cobas TaqScreen MPX V2.0 試劑說明書及《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2019版)中溶血、脂血程度對核酸檢測結(jié)果的影響情況，選擇驗(yàn)證的溶血標(biāo)本中血紅蛋白水平分別為0、50、150、250、500 mg/dL，脂血標(biāo)本中三酰甘油水平分別為0、800、1 700、2 500、3 300 mg/dL；選擇驗(yàn)證的HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的水平均為3倍最低檢出限(LOD)水平，分別為6.9、20.4 IU/mL 和150.9 IU/mL。溶血標(biāo)本選擇16例，脂血標(biāo)本選擇15例。

1.3.26 000 mg/dL三酰甘油溶液的配制 96 000 mg/dL的三酰甘油原液加核酸檢測陰性的無償獻(xiàn)血者混合血漿分兩次做4倍稀釋，陰性混合血漿旋渦震蕩3 min，稀釋后的三酰甘油溶液旋渦震蕩至少10 min(0、800、1 700、2 500、3 300 mg/dL 5個(gè)水平梯度的脂血標(biāo)本均用6 000 mg/dL三酰甘油溶液配置)。

1.3.3溶血標(biāo)本原液的準(zhǔn)備 核酸檢測陰性的無償獻(xiàn)血者混合血漿加ELISA檢測陰性的紅細(xì)胞于-20 ℃冰箱反復(fù)凍融后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用血球計(jì)數(shù)儀測2次血紅蛋白，取均值，實(shí)驗(yàn)中所得溶血標(biāo)本原液血紅蛋白水平為900 mg/dL。

1.3.4不同水平溶血、脂血及3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA混合標(biāo)本的配制 用陰性血漿分別將 6 000 mg/dL三酰甘油溶液(900 mg/dL溶血標(biāo)本原液)和50 IU/mL的HBV DNA、200 IU/mL的HCV RNA、1 000 IU/mL的HIV RNA稀釋成三酰甘油水平分別為0、800、1 700、2 500、3 300 mg/dL(游離血紅蛋白水平分別為0、50、150、250、500 mg/dL)及3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA混合標(biāo)本。

1.3.5檢測方法 采用Pools of 1模式單檢，每個(gè)標(biāo)本單檢加樣量為1 000 μL。

1.4結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1試驗(yàn)結(jié)果的判讀規(guī)則 試劑盒陰陽對照、IC均有效，該批試驗(yàn)結(jié)果方可接受。

1.4.2溶血、脂血目測比色卡對檢測結(jié)果的判讀要求 不同游離血紅蛋白水平的溶血標(biāo)本、不同三酰甘油水平的脂血標(biāo)本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA 3個(gè)項(xiàng)目均能檢出，該水平的溶血、脂血標(biāo)本方可接受。

2 結(jié) 果

2.1溶血標(biāo)本對核酸檢測項(xiàng)目檢出率的影響情況 游離血紅蛋白水平分別為0、50、150、250、500 mg/dL 的溶血標(biāo)本對3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA項(xiàng)目的檢出率均沒有影響(P>0.05)，見表1。

表1 不同水平梯度溶血對3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA檢出率的影響

2.2不同水平梯度溶血標(biāo)本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA Ct值的比較情況 不同水平溶血標(biāo)本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA 項(xiàng)目的Ct值與正常組(0 mg/dL組)標(biāo)本中的Ct值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同水平梯度溶血標(biāo)本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA Ct值的比較

2.3脂血標(biāo)本對核酸檢測項(xiàng)目檢出率的影響情況 三酰甘油水平為0、800、1 700、2 500 mg/dL 時(shí)對3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的檢出率均沒有影響(P>0.05)；3 300 mg/dL脂血標(biāo)本對HBV DNA、HCV RNA兩個(gè)項(xiàng)目的檢出率無影響(P>0.05)，但對HIV RNA的檢出率有影響(P<0.05)，見表3。

表3 不同水平梯度脂血對3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA檢出率的影響

2.4不同水平梯度脂血標(biāo)本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA 的Ct值比較情況 除3 300 mg/dL水平脂血標(biāo)本中3倍HIV RNA的Ct值外，其他不同水平三酰甘油的脂血標(biāo)本組中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的Ct值與正常標(biāo)本(0 mg/dL組)中的Ct值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同水平梯度脂血標(biāo)本中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的Ct值比較

2.53 300mg/dL 水平脂血對3倍LOD HIV RNA檢出率影響的補(bǔ)充試驗(yàn) 針對結(jié)果2.3中，15例3 300 mg/dL脂血標(biāo)本中有1例HIV RNA未檢出的情況，繼續(xù)補(bǔ)充10例標(biāo)本，以驗(yàn)證3 300 mg/dL脂血對HIV RNA項(xiàng)目的影響。配制方法：用陰性血漿將 6 000 mg/dL三酰甘油溶液和1 000 IU/mL的HIV RNA質(zhì)控品稀釋成三酰甘油水平為3 300 mg/dL的3倍LOD HIV RNA混合標(biāo)本。采用Pools of 1模式單檢，10例3 300 mg/dL 水平脂血標(biāo)本中3倍LOD HIV RNA的檢出率為80%(8/10)，Ct值為36.85±1.14。

2.6目測比色卡 溶血標(biāo)本目測比色卡見圖1；脂血標(biāo)本目測比色卡見圖2。

圖1 溶血標(biāo)本目測比色卡

3 討 論

標(biāo)本采集作為血站實(shí)驗(yàn)室檢測前的重要環(huán)節(jié)，是血液檢測質(zhì)量保證的第一道關(guān)卡，標(biāo)本的狀態(tài)及質(zhì)量直接決定后續(xù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，故血站實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立適宜本實(shí)驗(yàn)室的溶血、脂血目測比色卡，以避免不合格溶血、脂血標(biāo)本進(jìn)入血液檢測過程，進(jìn)而確保血液核酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確，保障臨床用血安全。

表1顯示當(dāng)標(biāo)本中血紅蛋白水平分別為0、50、150、250、500 mg/dL 時(shí)對3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA項(xiàng)目的檢出率均沒有影響；表2中血紅蛋白為50、150、250、500 mg/dL的溶血標(biāo)本組中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA項(xiàng)目的Ct值與正常標(biāo)本(0 mg/dL組)中的Ct值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Cobas TaqScreen MPX V2.0 試劑盒說明書中顯示血紅蛋白最高達(dá)500 mg/dL時(shí)對檢測結(jié)果無影響，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定的不同水平血紅蛋白的溶血標(biāo)本對3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的檢測結(jié)果符合Cobas TaqScreen MPX V2.0 試劑盒說明書要求。

表3顯示標(biāo)本中三酰甘油水平分別為0、800、1 700、2 500 mg/dL 時(shí)對3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA項(xiàng)目的檢出率均沒有影響；3 300 mg/dL水平脂血標(biāo)本對HBV DNA、HCV RNA兩個(gè)項(xiàng)目的檢出率無影響，但對HIV RNA的檢出率有影響。表4中除3 300 mg/dL水平脂血標(biāo)本中3倍LOD HIV RNA的Ct值組外，其他不同水平三酰甘油的脂血標(biāo)本組中3倍LOD HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA項(xiàng)目的Ct值與正常標(biāo)本(0 mg/dL組)中的Ct值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表3和3 300 mg/dL水平脂血標(biāo)本對3倍LOD HIV RNA檢出率影響的補(bǔ)充試驗(yàn)中，3 300 mg/dL水平脂血且3倍LOD HIV RNA陽性標(biāo)本的測試數(shù)共25例，其中檢出HIV RNA陽性22例，總檢出率為88%(22/25)，小于95%的置信區(qū)間，并結(jié)合本研究1.4.2的要求，判定三酰甘油水平為3 300 mg/dL的脂血標(biāo)本對HIV RNA的檢出率有影響，該情況與Cobas TaqScreen MPX V2.0 試劑盒說明書中三酰甘油水平最高達(dá)3 300 mg/dL時(shí)對檢測結(jié)果無影響的內(nèi)容不符合，分析原因可能有：(1)商品化的三酰甘油溶液不能百分百模擬人源性的脂血，導(dǎo)致檢測結(jié)果有差異；(2)本試驗(yàn)方案測試數(shù)較少，不能代表試劑盒測試過程的實(shí)際狀態(tài)；(3)3 300 mg/dL三酰甘油的脂血標(biāo)本在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中用Cobas TaqScreen MPX V2.0 試劑盒檢測時(shí)，對HIV RNA的檢出率確實(shí)有影響。

陳雪等[11]研究中血紅蛋白水平為682 mg/L(68.2 mg/dL)、三酰甘油水平為15 009.6 mg/L(1 500.96 mg/dL)不會影響 HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的檢測結(jié)果；張龍穆等[12]報(bào)道中度、重度脂血不會導(dǎo)致核酸檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性；張翠莉等[13]研究中溶血和脂血對實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HBV DNA結(jié)果無影響。本研究的結(jié)論與上述研究結(jié)果并不完全一致，可能與不同研究中血紅蛋白、三酰甘油設(shè)定的水平梯度、檢測分析方法及檢測系統(tǒng)不同等因素有關(guān)，所以需建立適合本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、檢測系統(tǒng)、分析方法的溶血、脂血比色卡。

溶血標(biāo)本目測比色卡(圖1)中不同溶血程度目測觀察較明顯，易于操作；脂血標(biāo)本目測比色卡(圖2)中800、1 700、2 500、3 300 mg/dL 脂血程度目測觀察區(qū)別不顯著，可能與使用商品化三酰甘油原液配制所得相關(guān)，所以實(shí)際操作中，標(biāo)本接收人員應(yīng)仔細(xì)甄別，對于明顯高于或與3 300 mg/dL 水平相當(dāng)?shù)闹獦?biāo)本，在保證標(biāo)本和獻(xiàn)血者溯源性的前提下，可重新采樣，若兩次采樣標(biāo)本均為同等脂血標(biāo)本，則拒絕接收；對于接近2 500～3 300 mg/dL 水平的脂血標(biāo)本，可做特殊標(biāo)識，試驗(yàn)前采取高速離心后去除上層脂漿的措施[14]保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

筆者在本次溶血、脂血比色卡建立過程中有以下幾方面的建議和思考：(1)以核酸檢測結(jié)果建立的溶血、脂血比色卡是否適合于血型檢測，還有待進(jìn)一步確認(rèn)；(2)溶血標(biāo)本的制備盡量在實(shí)驗(yàn)前2～3 d開始，不宜過早準(zhǔn)備，避免凍融的過程中滋生細(xì)菌，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；(3)溶血標(biāo)本反復(fù)凍融后，離心吸取上清時(shí)避免晃動，減少細(xì)胞碎片對檢測結(jié)果的影響；(4)有條件的實(shí)驗(yàn)室可收集臨床脂血標(biāo)本做比色卡驗(yàn)證，若必須要用商品化三酰甘油，則配制過程中旋渦震蕩混勻環(huán)節(jié)必須超過10 min，使配制溶液充分混勻，且混勻后立即上機(jī)檢測；(5)脂血比色卡實(shí)驗(yàn)全過程中實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)保持25 ℃左右，不得低于20 ℃，防止脂肪層析出影響檢測結(jié)果；(6)標(biāo)本管的貼簽應(yīng)不占滿管體，方便接收人員查看標(biāo)本采集量及標(biāo)本狀態(tài)。