離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定血漿和尿液中百草枯和敵草快

張秀堯, 蔡欣欣, 張曉藝, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

圖 1 百草枯和敵草快的化學結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of paraquat (PQ) and diquat (DQ)

百草枯(paraquat, PQ)和敵草快(diquat, DQ)為世界上產(chǎn)量第二和第三的滅生型除草劑(化學結(jié)構(gòu)見圖1),二者常配伍使用。百草枯對人類的毒性極大,中毒時病變主要發(fā)生于肺部,稱為百草枯肺。百草枯可使患者肺細胞纖維化,氣體交換嚴重受損,致使患者血液和組織缺氧而最終導(dǎo)致死亡[1-4]。百草枯的中毒多因自殺吞服引起,2016年7月1日起,我國明令禁止百草枯水劑在國內(nèi)使用和出售,此后敵草快的銷量逐漸上升,敵草快中毒的患者也隨之增多。敵草快的生產(chǎn)成本較百草枯高,有少數(shù)商家為了牟利,將百草枯改名為“敵草快”或?qū)俨菘輷饺霐巢菘熘谐鍪邸巢菘鞂儆谥械榷拘猿輨?毒理作用與百草枯相似,但毒性小于百草枯,也可引起死亡[5-7]。百草枯和敵草快中毒病人目前無特效治療藥,中毒病死率高,對血漿和尿液中百草枯和敵草快濃度的同時監(jiān)測,可以為臨床早期診斷和預(yù)后提供有價值的信息。

血漿和尿液中百草枯和敵草快的主要檢測方法有紫外分光光度法[8]、液相色譜法[9-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-13],其中液相色譜-質(zhì)譜法是檢測百草枯和敵草快最常用方法,然而百草枯和敵草快均為強極性水溶性化合物,在反相色譜柱上難以保留。在流動相中加入離子對試劑,如七氟丁酸(HFBA),有助于反相色譜柱保留PQ和DQ[11,13],但離子對試劑有離子抑制作用,會降低質(zhì)譜檢測的靈敏度,同時還會給質(zhì)譜系統(tǒng)增加額外的污染,也有采用親水色譜(HILIC)-質(zhì)譜法分離血漿和尿液中PQ和DQ[12,14-17],但流動相中需加入高濃度的甲酸銨緩沖鹽,也會影響質(zhì)譜的響應(yīng)值,同時親水色譜法分離易受基質(zhì)成分影響,保留時間不穩(wěn)定。

離子色譜-質(zhì)譜法在環(huán)境和食品檢測中的應(yīng)用越來越廣泛[18-20],近年來也開始應(yīng)用于生物樣品的檢測[21,22],但多采用陰離子交換色譜與質(zhì)譜聯(lián)用。有關(guān)陽離子交換色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定血漿和尿液中百草枯和敵草快的檢測方法鮮有文獻報道?？紤]到百草枯和敵草快在水溶液中以雙電荷聯(lián)吡啶離子狀態(tài)存在,更適合采用陽離子交換色譜法分離,本文將血漿和尿液樣品的水稀釋液直接通過混合型聚合物反相吸附和弱陽離子交換的固相萃取柱(Oasis WCX SPE)進行凈化,處理液中待測化合物經(jīng)陽離子交換色譜柱分離,三重四極桿質(zhì)譜法檢測,穩(wěn)定同位素內(nèi)標法定量,方法靈敏、準確、精密。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

離子色譜系統(tǒng)由Dionex ICS-1100離子色譜儀、淋洗液發(fā)生器(RFC-30)、電解再生抑制器(CDRS 600)和自動進樣器(DV-AS)組成,由變色龍工作站(7.22版)控制(美國Thermo Scientific公司); QTRAP 6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國Millipore公司)。

甲醇、甲酸和乙腈均為色譜級(德國Merck公司); Oasis WCX混合型聚合物反相吸附和弱陽離子交換固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國Waters公司),臨用時分別用各3.0 mL甲醇和水活化;百草枯二氯化物(純度為97.5%)和敵草快二溴化物標準物質(zhì)(純度為98.0%)(德國Dr. Ehrenstorfer公司),百草枯-d8二氯化物(純度為98.5%)和敵草快-d4二溴化物標準物質(zhì)(純度為98.7%) (加拿大CDN公司)。健康人血漿經(jīng)浙江省衛(wèi)生行政部門審批,由溫州市中心血站提供,尿液由健康志愿者提供。

用水溶解標準物質(zhì)并稀釋成1.00 mg/mL的標準儲備溶液,于-20 ℃保存。臨用時再用水稀釋成混合標準工作溶液,其中百草枯和敵草快的質(zhì)量濃度分別為2.0 μg/mL和1.0 μg/mL;用水稀釋制成混合內(nèi)標工作溶液,其中百草枯-d8和敵草快-d4的質(zhì)量濃度分別為0.20 μg/mL和0.10 μg/mL。

1.2 實驗條件

1.2.1樣品前處理

吸取100 μL血漿或尿液,置于2 mL Eppendrof管中,加入10 μL混合內(nèi)標工作溶液,混勻,放置30 min,再加入900 μL水,混勻,以1.0 mL/min的流速上樣于Oasis WCX SPE柱,分別用3.0 mL水和甲醇淋洗,再用2.0 mL含2%(v/v)甲酸的88%(v/v)乙腈水溶液洗脫,洗脫流速為1.0 mL/min,洗脫液收集于5 mL Eppendorf管中,于50 ℃氮氣吹干,加入1.0 mL水,旋渦溶解,溶解液轉(zhuǎn)移入0.5 mL帶濾頭自動進樣瓶中,待測。

1.2.2色譜條件

分析柱為Ionpac CS 18型色譜柱(250 mm×2 mm, 6.0 μm),保護柱為CG18(50 mm×2 mm, 7.0 μm), CDRS 600陽離子抑制器(2 mm,外加水模式),甲磺酸(MSA)淋洗液由RFC-30在線自動產(chǎn)生。梯度淋洗程序:0～4.0 min, 30 mmol/L MSA; 4.0～7.0 min, 30 mmol/L MSA～60 mmol/L MSA; 7.0～11.0 min, 60 mmol/L MSA; 11.0～11.1 min, 60 mmol/L MSA～30 mmol/L MSA; 11.1～15.0 min, 30 mmol/L MSA。淋洗液流速為0.30 mL/min;柱溫為45 ℃;通過三通裝置在抑制器流出液中泵入3%(v/v)甲酸乙腈溶液,流速為0.30 mL/min,進樣體積為10 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子掃描方式,多離子監(jiān)測(MRM)模式檢測。離子化電壓(IS): 4 500 V,離子源溫度(TEM): 600 ℃,氣簾氣(CUR)壓力:277 kPa,噴霧氣(GS1)壓力:277 kPa,輔助加熱氣壓力(GS2): 414 kPa,碰撞器(CAD)壓力強度:Medium;優(yōu)化后的各待測物的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量等參數(shù)見表1。

表 1 百草枯、敵草快及同位素內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖 2 百草枯和敵草快前體離子的質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of precursor ions of paraquat and diquat

圖 3 百草枯和敵草快及同位素內(nèi)標物的子離子質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of product ions of paraquat, paraquat-d8, diquat and diquat-d4

2.1.2離子色譜條件優(yōu)化

百草枯和敵草快屬季銨鹽化合物,極性大,反相色譜柱難以保留,有文獻采用離子對反相色譜法[11,13,24]和親水作用色譜法[14-17,23]分離百草枯和敵草快,也有使用基于離子液體機理的Trinity P1[25]和Trinity Q1色譜柱來分離[26]。百草枯和敵草快極易被玻璃和不銹鋼等材料吸附,(超)高效液相色譜儀的管路和色譜柱大都是不銹鋼材質(zhì),同時硅膠基色譜柱上殘留的硅羥基對帶正電荷的PQ和DQ會有二級吸附作用,表現(xiàn)為較寬且拖尾的色譜峰,為了減少吸附,往往在流動相中加入較高濃度的甲酸銨或離子對試劑,而高濃度的緩沖鹽和離子對試劑對質(zhì)譜信號有抑制作用,且會對質(zhì)譜系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。

離子色譜儀的管路為全聚醚醚酮(PEEK)材料,不會非特異吸附PQ和DQ, IonPac CS 18型色譜柱為中等容量羧酸型弱陽離子交換聚合物基的色譜柱,特別適合PQ和DQ的分離。采用淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生的甲基磺酸作為流動相進行梯度洗脫分離,PQ和DQ在Ionpac CS 18色譜柱上能很好保留。PQ和DQ在化學結(jié)構(gòu)上屬于同系物,只能實現(xiàn)部分分離,采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行檢測時,只要二者在質(zhì)譜通道上沒有相互干擾,即使只有部分分離也不影響定量分析，但PQ和DQ的相對分子質(zhì)量只相差2,不確定在質(zhì)譜通道上是否有相互干擾。因此本實驗首先進樣PQ,然后在DQ質(zhì)譜通道上沒有觀察到色譜峰，再進樣DQ,在PQ質(zhì)譜通道上也沒有觀察到色譜峰,說明它們不存在相互干擾。色譜柱流出液經(jīng)陽離子抑制器抑制,去除了流動相中甲基磺酸根離子等陰離子后生成純水,實驗發(fā)現(xiàn),純水體系進入質(zhì)譜離子源不利于PQ和DQ的離子化。有文獻[27]報道,利用高壓泵以一定的比例泵入乙腈、甲醇等有機溶劑通過三通裝置與抑制器流出液匯合后再進入質(zhì)譜進行測定,可以改善待測物的電離效果,從而使質(zhì)譜信號有數(shù)倍增加?？紤]到如果泵入甲醇,與水混合易產(chǎn)生氣泡,且壓力較高,而陽離子抑制器中膜的耐壓為692 kPa,而乙腈與水混合后壓力較低,因此選擇泵入乙腈,觀察到PQ和DQ的響應(yīng)值有所增高。實驗比較了以0.10、0.20和0.30 mL/min的流速泵入乙腈時的質(zhì)譜響應(yīng)值,結(jié)果表明,泵入的流速≥0.20 mL/min時,PQ和DQ質(zhì)譜響應(yīng)值最高,與不泵入乙腈相比,響應(yīng)值有1～2倍提高。但僅泵入乙腈,PQ和DQ在質(zhì)譜上有殘留,使得基線抬高,這可能是離子源上電噴霧針為金屬材料,其吸附PQ和DQ,而引起的殘留效應(yīng)。在乙腈中加入甲酸可以減少殘留效應(yīng),實驗選用含3%(v/v)甲酸的乙腈溶液作為柱后泵入溶劑,流速為0.30 mL/min時,可完全消除殘留效應(yīng)。加標血漿樣品中百草枯(1.0 μg/L)和敵草快(0.5 μg/L)的色譜圖見圖4。

圖 4 空白和加標血漿樣品中百草枯和敵草快的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of paraquat and diquat in blank and spiked plasma samples

2.1.3前處理條件優(yōu)化

血漿和尿液中PQ和DQ的提取和凈化方法有很多,包括乙腈蛋白沉淀法[14-15]、甲醇蛋白沉淀法[16]、液液萃取法(LLE)[28]和固相萃取法(SPE)[13,17,24]等。蛋白沉淀法凈化效果不佳,基質(zhì)效應(yīng)(ME)比較嚴重;LLE回收率不高,操作煩瑣;基于強(弱)陽離子交換機理[17,24]和反相色譜機理[13]的固相萃取法已成功用于PQ和DQ的提取和凈化?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)和回收率等綜合因素,本法采用混合型聚合物反相吸附和弱陽離子交換的固相萃取柱,用于樣品的前處理。

考慮到PQ和DQ中毒大多數(shù)是由自殺引起的,血漿和尿液中PQ和DQ濃度往往較高,故將洗脫液氮氣吹干后溶于1.0 mL水中,稀釋樣品10倍。取來自6份不同個體的血漿和尿液樣品,經(jīng)樣品前處理后進樣分析,結(jié)果顯示內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾待測物的測定。因為PQ和DQ易被玻璃材料吸附,故操作全程應(yīng)避免接觸玻璃器皿。

2.2 方法學考察

2.2.1線性范圍、檢出限和定量限

對系列混合標準工作溶液和混合內(nèi)標工作溶液進行分析,其中百草枯的質(zhì)量濃度分別為1.0、3.0、10、20、100和150 μg/L,敵草快的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、5.0、10、50和75 μg/L,百草枯-d8和敵草快-d4的質(zhì)量濃度分別為2.0 μg/L和1.0 μg/L,采用MultiQuant定量軟件處理,以定量離子對與內(nèi)標物的峰面積比值(Y)對物質(zhì)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進行線性回歸(權(quán)重取1/X)。結(jié)果表明,百草枯和敵草快分別在1.0～150 μg/L和0.5～75 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程分別為Y=0.508X+0.029 3和Y=0.365X+0.016 6,相關(guān)系數(shù)均>0.999。

在空白血漿和尿液樣品中分別加入系列低濃度的待測物進行測定,以兩對分子離子對的信噪比均≥3和≥10時的樣品濃度作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果測得血漿和尿液中百草枯和敵草快的檢出限分別為0.3 μg/L和0.2 μg/L,定量限分別為1.0 μg/L和0.5 μg/L,能夠滿足中毒檢測的要求。

表 3 血漿和尿液中PQ和DQ的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n=5)

2.2.2加標回收率和精密度試驗

按歐洲藥品管理局(EMEA)的要求[29]在定量限、3倍定量限(low QC)、中等濃度(medium QC)和高濃度(high QC)進行加標回收率和精密度試驗,在空白血漿和尿液中加標使百草枯和敵草快的質(zhì)量濃度分別為1.0、3.0、20、120 μg/L和0.5、1.5、10、60 μg/L,每個水平平行測定6次,血漿中百草枯和敵草快的平均加標回收率分別為93.5%～117%和91.7%～112%,相對標準偏差(RSD)分別為3.4%～16.7%和2.8%～13.2%;尿液中百草枯和敵草快的平均加標回收率分別為90.0%～118%和99.2%～116%, RSD分別為5.6%～14.9%和2.4%～17.3%(見表2)。結(jié)果符合EMEA的要求。

2.2.3基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

在空白血漿和尿液的前處理液中加入PQ(1.0、3.0、20、120 μg/L)和DQ(0.5、1.5、10、60 μg/L)混合標準工作溶液制成基質(zhì)標準溶液,測定PQ和DQ的峰面積(A),再測定相同水平溶劑標準溶液中PQ和DQ的峰面積(B),平行測定5次。根據(jù)公式ME=A/B×100%[30]計算基質(zhì)效應(yīng)。

提取回收率為空白血漿和尿液加標樣品中PQ和DQ的峰面積(C)與相同水平基質(zhì)標準溶液中PQ和DQ的峰面積之比,公式為提取回收率=C/A×100%[30]。PQ和DQ的評估水平分別為1.0、3.0、20、120 μg/L和0.5、1.5、10、60 μg/L,平行試驗5次(見表3)。結(jié)果顯示,PQ和DQ在血漿和尿液中存在一定的基質(zhì)效應(yīng),可以通過穩(wěn)定同位素稀釋法進行定量,校正樣品的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收的不完全。

表 2 空白血漿和尿液樣品中PQ和DQ的加標回收率

2.2.4穩(wěn)定性試驗

各取3份加標血漿和尿液樣品,其中百草枯和敵草快質(zhì)量濃度為10 μg/L和5 μg/L,將樣品處理液在自動進樣器上室溫放置72 h,每間隔24 h測定1次,與標稱值比較,結(jié)果顯示百草枯和敵草快的相對偏差均在±10%之間。

取低水平(百草枯3.0 μg/L和敵草快1.5 μg/L)和高水平(百草枯130 μg/L和敵草快65 μg/L)的血漿和尿液樣品,儲藏于具塞聚丙烯離心管中,分別在經(jīng)過3個冷凍(-20 ℃)與室溫融化過程、冷藏(2～6 ℃)保存5 d和-20 ℃冷凍保存1個月后再測定,與標稱值比較,測得百草枯和敵草快的相對偏差均在15%以內(nèi),符合要求。

3 結(jié)論

本文建立了測定血漿和尿液中百草枯和敵草快的離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測方法,通過對精密度、準確度和靈敏度等方法學考察,驗證了方法的有效性,結(jié)果表明該方法可用于百草枯和敵草快的中毒檢測。