快速皂化-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定乳粉中膽固醇和維生素E 4種異構(gòu)體

應(yīng) 璐, 張書芬, 邢家溧,*, 李 楊, 王小寶, 畢曉麗, 周鑫達(dá)

(1. 寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院, 浙江 寧波 315048; 2. 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

膽固醇和生育酚都是人體所必需的重要營養(yǎng)元素,是乳粉中的重要質(zhì)量指標(biāo)。人體血液中的膽固醇濃度是高血脂癥的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[1],膽固醇參與人體代謝,是合成類固醇激素的原料,也是膽汁酸、激素和維生素D的前體[2,3]。維生素E(vitamin E, VE)又稱生育酚,是一種人體必需的脂溶性維生素,對(duì)維持人體正常生理功能起重要作用,能提高機(jī)體免疫力和生育能力,也是人體內(nèi)最重要的抗氧化劑[4-6]。維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類8種化合物[7],其中生物效價(jià)較高的4種是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚[8,9]。

目前,國家標(biāo)準(zhǔn)中用于檢測(cè)食品中膽固醇和維生素E是兩個(gè)不同的方法[10,11],且均需要經(jīng)過傳統(tǒng)的加熱回流皂化、分液漏斗多次液液萃取、洗滌、濃縮,再用高效液相色譜或氣相色譜法分離,而文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于維生素E或者膽固醇的方法[12-14]幾乎也都是與國家標(biāo)準(zhǔn)相同的前處理方法。這些前處理方法過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),色譜法分離膽固醇的干擾較大。此外,嚴(yán)婉盈等[15]采用固相萃取(SPE)法測(cè)定膽固醇,但是該方法只能測(cè)定游離膽固醇而非總膽固醇[16],影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑒于乳粉基質(zhì)成分復(fù)雜,該文獻(xiàn)將SPE用于測(cè)定植物油的方法并不適用于乳粉的前處理?？紤]到目前對(duì)于膽固醇和混合生育酚同時(shí)檢測(cè)的方法報(bào)道甚少,本研究通過多次實(shí)驗(yàn)摸索了一套適用于各種乳粉中膽固醇和混合生育酚定性定量檢測(cè)的方法,采用簡(jiǎn)易皂化萃取的前處理方法,用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下定性和定量,相比簡(jiǎn)單的氣相色譜、液相色譜及單級(jí)質(zhì)譜更加準(zhǔn)確。本研究將此快速法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法[10,11]進(jìn)行了比對(duì),并將本方法應(yīng)用于同時(shí)快速測(cè)定各種乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ800Evo氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾公司);萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); SW22恒溫振蕩水浴槽(德國優(yōu)萊博公司); ST16離心機(jī)(美國賽默飛世爾公司); VORTEX 3渦旋混合儀(廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司)。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97.2%,德國Dr. Ehrenstorfer); DL-α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度96.6%,曼哈格)、β-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.08%, SUPELCO)、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.0%, SUPELCO)和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度93.0%, SUPELCO);氫氧化鉀和磷酸二氫鉀(分析純,國藥集團(tuán));正己烷(色譜純,德國默克);脂肪酶(L1754-100 g, SIGMA),酶活為1 229 U/mg;所用水均為超純水。

樣品:隨機(jī)購買市售的嬰幼兒配方乳粉20種,低脂乳粉4種。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取0.010 5 g膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品,正己烷溶解并定容至10.00 mL,配制成1.00 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,保存于-18 ℃冰箱中。分別準(zhǔn)確稱取0.010 4 gα-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品,0.010 1 gβ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、0.010 3 gγ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、0.010 8 gδ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品,分別用無水乙醇溶解并定容至10 mL,分別得到1.00 g/L的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,保存于-18 ℃冰箱中,備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:量取適量的膽固醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,配制成膽固醇含量為200 mg/L,α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量均為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,備用。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:由于加標(biāo)回收率考察的含量和實(shí)際樣品中的含量差距較大,因此,配制兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于10 mL棕色容量瓶中,正己烷定容至刻度,標(biāo)準(zhǔn)系列1中膽固醇的質(zhì)量濃度為:0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)系列2中膽固醇的質(zhì)量濃度為:5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)系列1中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的質(zhì)量濃度均為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)系列2中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的質(zhì)量濃度均為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L。

400 g/L氫氧化鉀溶液:稱取20 g氫氧化鉀于100 mL燒杯中,用20 mL水溶解,冷卻后,加水定容至50 mL,儲(chǔ)存于聚乙烯瓶中。

磷酸鹽緩沖液(pH 8.0): 稱取54.0 g磷酸二氫鉀溶解于300 mL水中,用400 g/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,加水定容至500 mL。

1.3 樣品前處理

1.3.1酶解和快速皂化

稱取乳粉樣品2.00 g于50 mL離心管中,加入5 mL溫水溶解,加入0.2 g脂肪酶,5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0),混勻后置于37 ℃振蕩水浴中酶解4 h。取出后立即冷卻,待冷卻至室溫后依次加入1 g碳酸鉀、10 mL超純水、10 mL無水乙醇,充分混合后于25 ℃水浴振蕩10 min。

1.3.2萃取

加入5 mL正己烷充分渦旋萃取10 min, 4 000 r/min離心6 min,取上清液過0.22 μm有機(jī)膜,待測(cè)定。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱TG-5MS Sil(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度280 ℃,程序升溫,不分流模式進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL,載氣流速1.5 mL/min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊電離源(EI),掃描方式為正離子掃描,MRM模式,離子源溫度300 ℃,接口溫度300 ℃。其他參數(shù)見表1。

表 1 5種物質(zhì)的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的優(yōu)化

參照嚴(yán)婉盈等[15]研究成果以TG-5MS Sil色譜柱分離,并通過改變升溫程序,初始柱溫150 ℃,保持1 min,然后以10 ℃/min升至280 ℃,保持12 min,最后20 ℃/min升至300 ℃,保持3 min,使得本研究的5種目標(biāo)化合物得到較好的分離且峰形較好(見圖1)。

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過將5種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離并全掃描,再與NIST譜庫進(jìn)行對(duì)照,可以得到5種物質(zhì)的質(zhì)譜圖,每種物質(zhì)選擇了3～4種強(qiáng)度較高的特征離子,再通過儀器的AutoSRM功能,為每種物質(zhì)優(yōu)化選擇出兩對(duì)離子對(duì)及其對(duì)應(yīng)的碰撞電壓(見表1), 5種物質(zhì)的定量離子提取圖見圖1。

圖 1 5種物質(zhì)的定量離子提取圖Fig. 1 Quantitative ion extraction diagram of the five substances

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為了探究最優(yōu)的前處理?xiàng)l件,先選定一個(gè)膽固醇和4種生育酚含量較低的脫脂乳粉樣品作為空白基質(zhì),5種物質(zhì)的加標(biāo)含量均為2.0 mg/100 g,分別考察酶解時(shí)間、皂化溫度、萃取溶劑的種類、溶劑體積以及萃取時(shí)間對(duì)回收率的影響,每個(gè)條件平行測(cè)定3次,以加標(biāo)回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)選出最優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

2.2.1酶解時(shí)間

考慮到膽固醇和生育酚都是脂溶性物質(zhì),脂肪酶酶解作為一種溫和的酶解手段,可以將膽固醇和生育酚游離出來,并且避免了高溫強(qiáng)堿環(huán)境。本研究固定條件:皂化溫度25 ℃,水浴振蕩,萃取溶劑及體積為正己烷5 mL,萃取時(shí)間為5 min,考察在37 ℃條件下酶解時(shí)間(2、4、12 h)對(duì)回收率的影響,乳粉中膽固醇和4種生育酚的回收率見圖2。酶解4 h條件下乳粉中膽固醇和4種生育酚的回收率最高,達(dá)95.8%; 2 h和12 h乳粉中膽固醇和4種生育酚的回收率相差不大,均低于酶解4 h,其中酶解2 h回收率低可能是由于酶解時(shí)間短,乳粉未得到充分酶解,回收率偏低;酶解12 h回收率低,可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長(zhǎng),導(dǎo)致待測(cè)組分損失[17],因此選擇37 ℃下酶解4 h最佳。

圖 2 酶解時(shí)間對(duì)乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effects of enzymatic hydrolysis time on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Saponification temperature: 25 ℃; extraction solvent and volume: n-hexane 5 mL; extraction time: 5 min.

2.2.2皂化溫度

將在37 ℃酶解4 h后的樣品按照1.3.1節(jié)加入試劑,分別在25、40、80 ℃下水浴振蕩進(jìn)行皂化,使用5 mL正己烷萃取5 min。由圖3可看出,25 ℃水浴振蕩的條件下回收率最高,皂化效果最佳,因此選擇皂化溫度為25 ℃。

圖 3 皂化溫度對(duì)乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of saponification temperature on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Enzymatic hydrolysis time: 4 h; extraction solvent and volume: n-hexane 5 mL; extraction time: 5 min.

圖 4 萃取溶劑對(duì)乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effects of extraction solvent on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Enzymatic hydrolysis time: 4 h; saponification temperature: 25 ℃; extraction solvent volume: 5 mL; extraction time: 5 min.

圖 5 萃取溶劑體積對(duì)乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響(n=3)Fig. 5 Effects of solvent volume on the recoveries of cholesterol and the four tocopherols in milk powder (n=3) Enzymatic hydrolysis time: 4 h; saponification temperature: 25 ℃; extraction solvent: n-hexane; extraction time: 5 min.

2.2.3萃取溶劑和溶劑體積

以膽固醇和4種生育酚的溶解性作為萃取溶劑選擇的依據(jù),在固定條件(酶解時(shí)間4 h,皂化溫度25 ℃水浴振蕩,萃取溶劑體積為5 mL,萃取時(shí)間5 min)下分別考察正己烷[18]、乙醚/石油醚(1︰1, v/v)[10]、乙酸乙酯[10]作為萃取溶劑對(duì)回收率的影響,結(jié)果見圖4,可以看出乙酸乙酯的萃取效果最差,回收率最低至72.2%;乙醚/石油醚萃取效果優(yōu)于乙酸乙酯,膽固醇和4種生育酚的回收率有所提高;正己烷萃取效果最佳,回收率高達(dá)95.5%。

進(jìn)一步考察了萃取溶劑正己烷的體積對(duì)回收率的影響,在固定條件(酶解時(shí)間4 h,皂化溫度25 ℃水浴振蕩,萃取溶劑為正己烷,萃取時(shí)間5 min)下,考察了2、5、10 mL,結(jié)果見圖5。萃取溶劑體積為5 mL和10 mL時(shí)的回收率顯著高于2 mL,但萃取溶劑體積為5 mL和10 mL時(shí)的回收率結(jié)果無顯著差異,考慮到實(shí)驗(yàn)成本和環(huán)境問題,故最終選擇萃取溶劑的體積為5 mL。

2.2.4萃取時(shí)間

考察了溶劑萃取時(shí)間(5、10、15 min)對(duì)乳粉中膽固醇和4種生育酚回收率的影響,其他條件如下:酶解時(shí)間4 h、皂化溫度25 ℃(水浴振蕩)、萃取溶劑及體積為正己烷5 mL、萃取時(shí)間5 min。結(jié)果表明,萃取時(shí)間為10 min和15 min的回收率結(jié)果顯著高于5 min,但萃取時(shí)間為10 min和15 min的回收率無顯著差異,考慮到實(shí)驗(yàn)效率,選擇萃取10 min為最優(yōu)萃取時(shí)間。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在優(yōu)化條件下,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x, mg/L)為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo),擬合線性方程得出相關(guān)系數(shù)(r2),其中膽固醇在0.5～50.0 mg/L,α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚在0.25～25.0 mg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(見表2)。以最低加標(biāo)結(jié)果推算10倍信噪比對(duì)應(yīng)的含量為定量限,膽固醇的定量限為10.0 μg/100 g,4種生育酚的定量限均為5.0 μg/100 g。

表 2 膽固醇和生育酚的校準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

表 3 膽固醇和4種生育酚的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表 4 本研究方法與國標(biāo)方法測(cè)得結(jié)果的比較(n=6)

2.3.2回收率與精密度試驗(yàn)

以脫脂乳粉為樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)試驗(yàn),膽固醇加標(biāo)含量分別為1.0 mg/100 g、5.0 mg/100 g、25.0 mg/100 g, 4種生育酚加標(biāo)含量分別為0.1 mg/100 g、0.5 mg/100 g、2.5 mg/100 g,每一水平平行測(cè)定6次,計(jì)算方法的回收率和精密度,結(jié)果見表3。

2.4 本研究方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

考慮到加標(biāo)回收率并不能完全反映該方法對(duì)實(shí)際樣品的分解和萃取能力,尤其是本研究的5種物質(zhì)皆為脂溶性物質(zhì),與脂肪密切結(jié)合,加標(biāo)回收并不能真正驗(yàn)證酶解效果。為了考察本研究方法對(duì)實(shí)際乳粉樣品的測(cè)試效果,選取一種嬰幼兒乳粉樣品,按照本文方法測(cè)試該乳粉中5種物質(zhì)的含量,又按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82-2016《食品中維生素A、D、E的測(cè)定》第一法測(cè)定4種生育酚的含量,按照GB 5009.128-2016《食品中膽固醇的測(cè)定》第一法測(cè)定膽固醇含量,每一方法平行測(cè)定6次,結(jié)果見表4。

由表4可知,相較于國家標(biāo)準(zhǔn)方法,本研究方法測(cè)得的膽固醇含量略低,但其余4種生育酚的測(cè)定含量均比國家標(biāo)準(zhǔn)方法略高。經(jīng)顯著性分析,國家標(biāo)準(zhǔn)方法與本研究方法對(duì)該乳粉中膽固醇、4種生育酚含量的檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異(p>0.05)。相較于國家標(biāo)準(zhǔn)方法前處理操作繁瑣,且需要按照兩種前處理方法分別測(cè)定膽固醇和4種生育酚,本研究開發(fā)的方法更加快速、簡(jiǎn)便,便于實(shí)際乳粉中膽固醇和4種生育酚的同時(shí)快速檢測(cè)。

2.5 樣品分析

為了解目前市售嬰幼兒乳粉、其他低脂乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量狀況,利用上述所建立的分析方法,對(duì)20種嬰幼兒配方奶粉及4種低脂乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量進(jìn)行了分析測(cè)試,檢測(cè)結(jié)果見表5。

由表5可知,嬰幼兒配方乳粉中膽固醇與4種生育酚的含量均高于低脂乳粉:嬰幼兒乳粉中膽固醇含量最高可達(dá)81.4 mg/100 g,α-生育酚和β-生育酚的平均值分別是3.6 mg/100 g和2.0 mg/100 g,γ-生育酚和δ-生育酚含量均較低,平均值分別為0.26 mg/100 g和0.79 mg/100 g。

表 5 實(shí)際乳粉中膽固醇和4種生育酚的含量(n=3)

3 結(jié)論

現(xiàn)行膽固醇和4種生育酚的測(cè)定分別采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82-2016《食品中維生素A、D、E的測(cè)定》第一法和GB 5009.128-2016《食品中膽固醇的測(cè)定》。鑒于這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的前處理方法過程復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),而且不能同時(shí)測(cè)定膽固醇和4種生育酚。本研究開發(fā)了一種前處理只需經(jīng)過酶解、室溫(25 ℃)皂化、直接萃取3個(gè)步驟,不需要轉(zhuǎn)移和多次萃取,高效便捷,且可以批量處理樣品,對(duì)膽固醇和4種生育酚可以同時(shí)測(cè)定的方法。本方法檢出限、線性范圍、回收率均能滿足乳粉中膽固醇和4種生育酚的檢測(cè)要求。