固相萃取-衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定尿液中4種阿片類物質(zhì)

高 吭, 劉雅珣, 柯 威, 劉 凱, 倪瀏陽, 陶 濤

(1. 湖北省黃石市公安局, 湖北 黃石 435000; 2. 黃石市公安司法鑒定中心, 湖北 黃石 435000; 3. 黃石市毒品檢驗鑒定中心, 湖北 黃石 435000)

海洛因被聯(lián)合國列為一類管制毒品,也被中國列管為主要毒品之一。目前,我國240.4萬名吸毒人員中,海洛因濫用者為88.9萬名,占37%[1]。海洛因在人體內(nèi)通過脫乙?；饔醚杆俅x,生成O6-單乙酰嗎啡(O6-acetylmorphine),然后再緩慢地代謝為嗎啡(morphine)。公安機關(guān)使用膠體金尿檢板檢測尿液中的嗎啡[2,3]和O6-單乙酰嗎啡,作為吸食海洛因的判斷依據(jù)。而服用含嗎啡、可待因(codeine)和乙?？纱?acetyl codeine)的鎮(zhèn)咳藥[4,5],同樣會使嗎啡膠體金尿檢板呈陽性。

檢測尿液中嗎啡、O6-單乙酰嗎啡的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-8]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-12]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有樣品前處理簡單、檢測速度快和靈敏度高的優(yōu)點,缺點是價格昂貴、使用難度大、維護成本高、普及率低。高普及率的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀相比更符合實際工作的需要。董鑭等[11]報道利用液-液提取和丙酸酐衍生化法檢測生物樣品中的嗎啡,回收率在83.2%～87.4%之間,檢出限為0.02 μg/mL;何國標(biāo)等[12]報道了GDX403、C18和HLB 3種固相萃取柱對尿液中嗎啡、可待因、乙酰可待因和O6-單乙酰嗎啡的萃取效果,以HLB柱最優(yōu),回收率在79%～85%之間,其中嗎啡檢出限為0.05 μg/mL。

嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因和乙酰可待因在酸性條件下以陽離子狀態(tài)存在。本文選用MCX混合型陽離子交換固相萃取柱[13-16]萃取尿液中4種阿片類物質(zhì),再用N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)[17,18]作為衍生化試劑對嗎啡、O6-單乙酰嗎啡和可待因進行衍生,最后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定。該方法簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、可批量操作,適合尿液中4種阿片類物質(zhì)的快速檢測與定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AutoSPE-06plus六通道全自動固相萃取儀(廈門?？苾x器有限公司); Auto EVA 30位氮吹濃縮儀(廈門?？苾x器有限公司); 7890BGC-5977BMSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司); Purelab Option Q7超純水儀(英國ELGA公司); FD115干燥箱(德國IRM公司); TOLEDO FE20K pH計(美國METTLER公司); OASIS MCX 3cc LP Extraction Cartridge固相萃取柱(美國Waters公司)。

無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);氨水、甲酸(分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司);甲醇(色譜純,西隴化工股份有限公司);乙酸乙酯(色譜純,美國TEDIA公司);所用水為超純水,由Purelab Option Q7超純水儀制備。

衍生化試劑MSTFA(美國Sigma-Aldrich公司)。標(biāo)準(zhǔn)品:嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱?1 mg/mL,美國Cerilliant公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取4種阿片類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品100 μL,置于1 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,混勻,配制得100 μg/mL的阿片類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱保存待用;用甲醇稀釋,配制0.02、0.1、0.2、0.4、0.8、1、10、20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品的前處理

取待檢尿液5 mL,添加0.2 mol/L pH=6的磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL,混勻,離心,上清液待全自動固相萃取儀處理。

1.3.2固相萃取和衍生化

將MCX固相萃取柱安裝于全自動固相萃取儀上,固相萃取儀條件見表1。

洗脫液在60 ℃干燥氮氣流下濃縮至干,吹干后的殘渣置于105 ℃干燥箱內(nèi)干燥0.5 h,冷卻至室溫后取出,加入0.1 mL乙酸乙酯溶解殘渣,添加MSTFA 20 μL,混勻,密閉,微波爐功率385 W加熱2 min,液體轉(zhuǎn)移至樣品瓶內(nèi),上機檢測。

1.3.3色譜條件

色譜柱:HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Agilent公司);進樣口溫度:280 ℃;進樣方式:不分流進樣;載氣:高純氦氣(99.999%);流速:1 mL/min。升溫程序:初始溫度150 ℃,保持1 min,以10 ℃/min速率升至280 ℃,保持10 min。后運行溫度:300 ℃;后運行時間:3 min;傳輸線溫度:280 ℃。

1.3.4質(zhì)譜條件

離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃;采集類型:全掃描;質(zhì)量數(shù)范圍:35～500 amu;溶劑延遲時間:4 min?？纱?、嗎啡和O6-單乙酰嗎啡的衍生化產(chǎn)物分別為:O6-三甲基硅烷基可待因(codeine, TMS derivative),O3,O6-雙(三甲基硅烷基)嗎啡(morphine, 2TMS derivative)和O3-三甲基硅烷基-O6-乙?；鶈岱?O6-acetylmorphine, TMS derivative),它們和乙酰可待因的保留時間、定性離子和定量離子見表2,質(zhì)譜圖見圖1。

表 1 尿液樣品的固相萃取條件

表 2 4種分析物的保留時間、定性離子和定量離子

圖 1 (a)O6-三甲基硅烷基可待因、(b)O3,O6-雙(三甲基 硅烷基)嗎啡、(c)O3-三甲基硅烷基-O6-乙?；鶈岱群?d)乙酰可待因的質(zhì)譜圖 Fig. 1 Mass spectra of (a) codeine, TMS derivative, (b) morphine, 2TMS derivative, (c) O6-acetylmorphine, TMS derivative, and (d) acetyl codeine

2 結(jié)果與討論

2.1 上樣和洗脫流速的選擇

本實驗分別考察了上樣和洗脫流速為0.5, 1.0, 2.0, 3.0 mL/min時4種阿片類物質(zhì)的回收率。如圖2所示,隨著上樣流速升高,4種阿片類物質(zhì)的回收率隨之下降,但選擇1.0 mL/min上樣流速時,回收率較0.5 mL/min時下降不明顯,因上樣總量加全自動固相萃取儀上樣死體積共計12 mL,為提高萃取效率,選擇1.0 mL/min的上樣流速。如圖3所示,選擇0.5 mL/min的洗脫流速時,洗脫液對固相萃取柱保留的阿片類物質(zhì)洗脫強度不足,回收率較低。當(dāng)洗脫流速大于等于1.0 mL/min時,回收率接近100%,且流速為1.0 mL/min時,誤差較低,因洗脫液僅2.5 mL,加快洗脫流速并不會對萃取效率帶來明顯提升,綜合考慮,選擇1.0 mL/min的洗脫流速。

圖 2 不同上樣流速對尿液中4種阿片類物質(zhì)回收率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of loading flow rate on the recoveries of the four opioids in urine (n=5)

圖 3 不同洗脫流速對尿液中4種阿片類物質(zhì)回收率的影響(n=5)Fig. 3 Effect of elution flow rate on the recoveries of the four opioids in urine (n=5)

2.2 淋洗液中甲酸體積分數(shù)的選擇

MCX填料可克服傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)混合型固相萃取吸附劑的局限性,具備離子交換和反相雙重保留模式。尿液中阿片類物質(zhì)在pH=6時呈陽離子狀態(tài),與MCX填料中的磺酸基相互作用得以保留,同時非極性及弱極性雜質(zhì)也保留在填料中的聚苯乙烯/二乙烯苯基體上。使用甲酸甲醇溶液淋洗固相萃取柱,可降低非極性及弱極性雜質(zhì)的干擾。本實驗考察了3種不同體積分數(shù)的甲酸甲醇淋洗液對回收率的影響,實驗結(jié)果如圖4所示,選擇3%(v/v)甲酸甲醇溶液淋洗去除雜質(zhì)時,回收率較高。

圖 4 不同體積分數(shù)的甲酸甲醇淋洗液對尿液中4種阿片類物質(zhì)回收率的影響(n=5)Fig. 4 Effect of volume percentage of formic acid in methanol washing solvent on the recoveries of the four opioids in urine (n=5)

2.3 淋洗液體積的選擇

用甲酸甲醇溶液淋洗雜質(zhì),會對保留在固相萃取柱上的阿片類物質(zhì)造成一定損失。本實驗考察了3種不同淋洗體積對回收率的影響,實驗結(jié)果如圖5所示。選擇1 mL 3%(v/v)甲酸甲醇溶液淋洗時,回收率較好。不使用3%(v/v)甲酸甲醇溶液淋洗的情況下,目標(biāo)物受基質(zhì)影響,回收率的離散程度較大。而隨著3%(v/v)甲酸甲醇溶液使用量增加至2 mL,阿片類物質(zhì)的損失隨之增加,回收率下降。

圖 5 不同體積的淋洗液對尿液中4種阿片類物質(zhì)回收率的影響(n=5)Fig. 5 Effect of volume of washing solvent on the recoveries of the four opioids in urine (n=5)

圖 6 不同體積分數(shù)的氨水甲醇洗脫液對尿液中4種阿片類物質(zhì)回收率的影響(n=5)Fig. 6 Effect of volume percentage of ammonium hydroxide in methanol eluent solvent on the recoveries of the four opioids in urine (n=5)

2.4 洗脫液中氨水體積分數(shù)的選擇

4種待測阿片類物質(zhì)在洗脫液中呈游離堿或陰離子狀態(tài),失去與磺酸基的相互作用。本實驗考察了3種不同體積分數(shù)的氨水甲醇溶液作為洗脫液對回收率的影響,實驗結(jié)果如圖6所示。使用3%(v/v)氨水甲醇溶液作為洗脫液時,回收率較差,當(dāng)洗脫液中氨水的體積分數(shù)大于5%時,回收率隨著氨水體積分數(shù)的上升變化不明顯。確定選擇5%(v/v)氨水甲醇溶液作為洗脫液。

2.5 固相萃取柱吹干時間的選擇

在固相萃取的操作中,為防止出現(xiàn)洗脫液和淋洗液不混溶時導(dǎo)致的乳化現(xiàn)象,會在洗脫前將固相萃取柱吹干。部分型號的固相萃取填料如C18等,如不吹干或吹得過干,回收率都會受到較大的影響,本實驗考察了使用0.1 MPa壓力的干燥氮氣流,在5種不同時長(1、3、5、8、10 min)下吹干固相萃取柱對回收率的影響。實驗結(jié)果如圖7所示,MCX固相萃取柱在不同的干燥程度下,回收率沒有明顯變化。為提高萃取效率,選擇將固相萃取柱吹干1 min。

2.6 固相萃取凈化效果

在優(yōu)化的固相萃取條件下,空白尿液中標(biāo)準(zhǔn)添加水平為0.2 μg/mL時,樣品的總離子流圖中4種分析物完全分離,峰形良好,基本消除了共流出的基質(zhì)雜質(zhì)(見圖8)。

圖 7 不同吹干時間對尿液中4種阿片類物質(zhì)回收率的影響(n=5)Fig. 7 Effect of cartridge drying time on the recoveries of the four opioids in urine (n=5)

圖 8 0.2 μg/mL加標(biāo)的空白尿液經(jīng)固相萃取凈化后的總離子流色譜圖Fig. 8 Total ion current chromatogram of blank urine spiked at 0.2 μg/mL purified by solid phase extraction

2.7 線性范圍、檢出限和定量限

將1 mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.02、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL)濃縮至干,在確定的實驗條件下檢測,以定量離子峰面積(y)對其在標(biāo)準(zhǔn)工作液中的質(zhì)量濃度(x, μg/mL)進行線性回歸,繪制校準(zhǔn)曲線,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r2)。結(jié)果顯示,4種分析物的線性關(guān)系良好,r2均大于0.998。按本實驗方法對0.02 μg/mL的空白加標(biāo)尿液進行檢測,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表3。

表 3 4種分析物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表 4 加標(biāo)尿樣中4種阿片類物質(zhì)的回收率、日內(nèi)精密度(n=5)

2.8 回收率和精密度

根據(jù)定量限及實際樣品中的含量范圍,在空白尿液中添加0.02、0.1、0.2 μg/mL 3個水平的阿片類物質(zhì)。按照已確定的方法,每個樣品平行檢測5次,考察日內(nèi)精密度;連續(xù)檢測3天,考察日間精密度。如表4所示,4種分析物的平均回收率為93.0%～110.3%,日內(nèi)精密度為2.6%～8.7%,日間精密度為4.1%～10.4%。

2.9 實際樣品的檢測

應(yīng)用本方法對服用過復(fù)方甘草片的志愿者尿樣進行檢測,該尿樣檢出嗎啡和可待因,其含量分別為0.091 5和0.012 6 μg/mL。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時測定尿液中嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因和乙酰可待因的方法。本方法樣品前處理采用MCX固相萃取柱萃取尿液中阿片類物質(zhì),用MSTFA三甲基硅烷化。結(jié)果表明,方法的線性關(guān)系良好,回收率和靈敏度高,具有定性定量準(zhǔn)確、快速的特點,可以滿足公安機關(guān)實際工作需要。