3D打印便攜式凝膠電泳裝置用于蛋白質的快速檢測

李瑩瑩, 王丁一, 農騏郢, 劉麗紅, 張 蒙,梁 勇,3, 胡立剛*, 何 濱, 江桂斌

(1. 江漢大學環(huán)境與健康研究院, 湖北 武漢 430056; 2. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室, 北京 100085; 3. 持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點實驗室, 湖北 武漢 430056)

快速、便攜、經濟型的現(xiàn)場檢測是環(huán)境監(jiān)測、污染治理和疾病預防與控制等的關鍵步驟。隨著分析化學、儀器儀表學、材料科學、生物化學以及生物工程學等方面技術的進步,儀器的微型化受到越來越多的關注[1-4]?？茖W儀器的微型化,可以滿足資源有限條件下進行快速檢測的需求。在分析檢測領域已經有多種開發(fā)完善的微型化儀器,如微型高速毛細管電泳儀[5-7]、微芯片臨床生化分析儀[8-10]、微型離心免疫分析儀[11]和微型高效液相色譜等[12,13]。便攜式分析儀器如移動酸堿度計、移動電化學檢測和便攜式光譜儀等也已被開發(fā)并投入市場使用。

目前,凝膠電泳(GE)技術是蛋白質研究中實現(xiàn)其有效分離的重要技術手段[14-16]。凝膠電泳技術以其分辨率高、重復性好和易操作等優(yōu)點,被廣泛地應用于分子生物學、生物化學、病理學和微生物學等學科的研究中[17-19]。例如之前研究[20]中設計的連續(xù)流動凝膠電泳與電感耦合等離子體質譜聯(lián)用(GE-ICP-MS)的金屬蛋白質在線分析系統(tǒng),其在金屬蛋白質的在線分離和檢測方面表現(xiàn)出良好的性能。同時,凝膠電泳技術對于臨床檢測中蛋白質的分離檢測具有重要意義。在資源少、實驗室設備和技術專長有限的環(huán)境中,將簡單、廉價和快速的制造用于診斷檢測的設備,有助于節(jié)約資源,降低成本。至今,凝膠電泳系統(tǒng)均屬于實驗室內使用儀器,體積較大,不便于攜帶,無法用于蛋白質樣品的現(xiàn)場檢測以及戶外使用。因此,開發(fā)穩(wěn)定、便攜式凝膠電泳系統(tǒng)對于現(xiàn)場檢測中的蛋白質分析具有實際意義。

與傳統(tǒng)制造工藝不同,3D打印加工更快速、準確,為低成本地加工復雜的系統(tǒng)提供了方便、可靠的方法。該技術的巨大優(yōu)勢使其在近幾十年得到快速發(fā)展,并被應用于許多領域[21-31]。隨著小型3D打印機的出現(xiàn)、打印材料種類的增加和相應成本的降低,3D打印逐漸被應用于更多的實驗室,制造越來越多的滿足分析化學和環(huán)境科學研究需求的定制設備[32,33]。例如,利用3D打印開發(fā)和加工微流體芯片和芯片實驗室[34-38]。這些研究表明,3D打印在裝置微型化的設計制造中具有廣闊的應用空間。

本研究中開發(fā)了一種便攜式凝膠電泳分析系統(tǒng)。所設計的便攜式凝膠電泳裝置主要在實驗室內通過3D打印加工。通過對預染蛋白質相對分子質量標準的分離,證實此裝置可在短時間內實現(xiàn)不同相對分子質量蛋白質的快速分離,并具有良好的分離性能。結合快速的蛋白質凝膠條帶染色技術,展現(xiàn)了潛在的現(xiàn)場應用潛力。開發(fā)的便攜式凝膠電泳裝置由桌面3D打印機可在5 h內制作完成,材料總成本小于400元人民幣。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

碳酸酐酶(CA)、卵白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白(CB)、核糖核酸酶A(RA)、預染蛋白質相對分子質量標準(Precision Plus ProteinTMDual Color Standards)、三(2-羰基乙基)磷酸鹽(TCEP)、十二烷基硫酸鈉(SDS),N,N,N′,N′-四亞甲基二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Sigma-Aldrich公司。甘氨酸(glycine)、30%丙烯酰胺溶液(acrylamide)購自美國VWR國際有限公司。甘油購自美國Affymetrix公司。0.5 mol/L的三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl, pH 6.8)和1.5 mol/L的Tris-HCl(pH 8.8)購自美國Bio-rad公司。無水乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)購自國藥集團化學試劑有限公司。One-Step BlueTM蛋白質凝膠染料購自美國Biotium公司。3D打印光固化樹脂購自美國Formlabs公司。去離子水(18.2 MΩ·cm)由美國Millipore超純水系統(tǒng)Milli-Q制備。所用試劑均為分析純。

儀器:Mini-PROTEAN?Tetra凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-rad公司,美國), Form2 3D打印機(Formlabs公司,美國),凝膠成像儀(UMAX PowerLook2100XL-USB,立廣電腦), 25 V恒壓鋰電池(容量:2 000 mAh,浩博電子有限公司)。

溶液配制:CA、OVA、BSA、CB、RA蛋白質儲備液(10 mg/mL)于-20 ℃避光儲存;上樣緩沖溶液:0.125 mol Tris(pH 6.8)+50%(v/v)甘油+8%(w/v)SDS+4%(v/v)β-巰基乙醇+0.04%(v/v)溴酚藍;電泳緩沖溶液:25 mmol Tris(pH 8.3)+192 mmol glycine+0.1%(v/v)SDS;分離前,5種標準蛋白質混合樣品(0.1 mg/mL)與上樣緩沖溶液按照體積比1∶3混合,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1凝膠電泳裝置的設計和制造

便攜式凝膠電泳裝置采用計算機輔助設計軟件SolidWorks 2017 (Dassault Systemes SE,法國)進行設計。設計的主要組件包括凝膠電泳槽、凝膠管(板)。具體設計制造過程如下:凝膠電泳槽的尺寸最大為50 mm×20 mm×30 mm。凝膠管內徑2.2 mm,外徑4.0 mm,長30 mm。水平凝膠板長25 mm,寬7.5 mm,凝膠厚1.5 mm。加樣孔寬4 mm,長1.5 mm。設計的凝膠電泳裝置數字模型生成.stl格式的文件,并傳輸至PreForm軟件(Formlabs公司)進行切片,在軟件中對模型進行設置,選擇合適的放置角度。設置打印參數:打印機選擇form2,打印材料選擇clear,打印精度0.1 mm;為防止影響模型使用,在參數設置中取消打印模型內部支撐的設置,保留外部支撐。在軟件內完成參數設置后即可將模型傳輸至Form2 3D打印機開始打印。所有設計、打印時間均在10 h內完成,耗費材料均在10 mL以內。打印完成后,從打印平臺去除模型,去除外部支撐,之后用無水乙醇對除去支撐后的模型進行清洗,防止多余的樹脂材料殘存。采用直徑0.1 mm、長約4 cm的鉑絲作為正、負極緩沖溶液槽的電極。

1.2.2電泳裝置性能測試

首先采用預染蛋白質相對分子質量標準對不同設計的便攜式凝膠電泳裝置的分離性能進行測試。兩種十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠比例用于預染蛋白質相對分子質量標準的分離。凝膠比例1: 5 mm長度的濃縮膠濃度為4%, 15 mm長度的分離膠濃度為10%;凝膠比例2: 5 mm長度的濃縮膠濃度為4%, 15 mm長度的分離膠濃度為15%。不同濃度凝膠配方見表1。

觀察兩種凝膠比例對于蛋白質相對分子質量標準的分離效果,選擇較好的一組進行不同濃縮膠和分離膠長度比例的分離效果比較,分離膠長度選擇5、10、15、20 mm。為有效觀測蛋白質條帶,所有分離預染蛋白質相對分子質量標準上樣量均為10 μL。選擇其中分離性能最好的一組進行后續(xù)的5種標準蛋白質分離,與Mini-PROTEAN?Tetra凝膠電泳系統(tǒng)的分離效果進行對比。上述蛋白質分離實驗均進行多次重復實驗。

表 1 SDS-PAGE膠詳細配方

柱狀凝膠制膠方式:首先采用注射器將分離膠注入凝膠管內,然后在已注入分離膠的凝膠管內注入去離子水,待分離膠凝固,將去離子水吸出,之后注入濃縮膠,最后加入去離子水進行水封,待用。板狀凝膠制膠方式:首先采用移液槍將分離膠注入凝膠板之間的空隙中,然后在已注入分離膠的凝膠板內注入去離子水,待分離膠凝固將去離子水吸出,之后注入濃縮膠,最后將梳子插入凝膠板,待用。制膠前,在所有凝膠管(板)外部標記灌膠高度,凝膠管(板)均用封口膜固定密封。

便攜式凝膠電泳運行條件:恒壓25 V至分離結束。

Mini-PROTEAN?Tetra凝膠電泳系統(tǒng)運行條件:60 V, 30 min; 100 V直至分離結束。

染色:5種標準蛋白質分離結束后,將凝膠從凝膠板上卸下。用One-Step BlueTM蛋白質凝膠染料(產品檢出限:10～20 ng)對蛋白質條帶進行染色。染色程序按產品說明書進行:將未固定的凝膠放入盛有25 mL One-Step BlueTM溶液的干凈容器中,在搖床上常溫孵育凝膠10～60 min,顯色即可。

2 結果與討論

2.1 裝置設計和優(yōu)化

在此前的工作中,我們已經采用3D打印開發(fā)了用于金屬結合蛋白分離的凝膠電泳裝置[20],驗證了3D打印凝膠電泳裝置的可行性,但是該裝置體積大,不便于攜帶。我們借鑒之前研究中凝膠電泳裝置的電泳槽結構,設計了一個微型化的水平凝膠電泳裝置,用于現(xiàn)場對蛋白質進行快速分離。所設計的凝膠電泳裝置主要由3部分組成:凝膠管(板)、凝膠電泳槽和電池。其中凝膠管(板)和凝膠電泳槽的主體通過實驗室內的一臺桌面級3D光固化打印機進行加工制造,整個制造過程可在短時間內完成,并能快速進行優(yōu)化和改進。

圖 1 電泳槽設計圖及實物圖Fig. 1 Design drawings and physical drawings of electrophoresis tanks a. Design A: double gel channel horizontal column electrophoresis tank; b. Design B: signal gel channel horizontal column electrophoresis tank; c. Design C: single gel channel horizontal column positive and negative electrophoresis tank; d. Design D: single gel channel horizontal slab positive and negative electrophoresis tank.

為使電泳裝置結構更合理、使用更加方便,我們對電泳槽的幾何結構和參數進行了多次測試和優(yōu)化。我們首先設計了包含雙凝膠通道(設計A,見圖1a)和單凝膠通道(設計B,見圖1b)兩種結構的電泳槽。設計A與設計B均采用兩種凝膠比例對標準蛋白質進行了分離,所用標準蛋白質為相對分子質量從10 kD到250 kD的商業(yè)化預染蛋白質相對分子質量標準,分離結果如圖2a-d所示。設計A分離時間5 h,設計B分離時間2 h。同一設計在相同分離時間內,15%濃度分離膠未能將10、15、20 kD的蛋白質完全分離,且10%濃度凝膠的整體分離效果均優(yōu)于15%濃度凝膠的整體分離效果,因此我們選擇10%濃度的分離膠開展接下來的實驗。分離相同蛋白質時,設計A所需時間明顯長于設計B,可能是由于設計A采用雙通道設計,分散了電流的強度,導致蛋白質在電場中移動減慢,分離時間增加。設計B雖然分離時間較短,但實驗過程中易產生正、負極電泳緩沖溶液相互滲透的現(xiàn)象,所以結構需要進一步的優(yōu)化。

圖 2 水平凝膠電泳槽的性能Fig. 2 Performance of the horizontal gel electrophoresis tank a. Design A, concentrated gel: 4%, separating gel: 15%; b. Design A, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%; c. Design B, concentrated gel: 4%, separating gel: 15%; d. Design B, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%; e. Design C, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%; f. Design D, concentrated gel: 4%, separating gel: 10%.

為此,我們將電泳槽結構改為正、負緩沖溶液槽分離的設計C(見圖1c);采用設計C的電泳槽電泳緩沖溶液不會相互滲透,且其完全分離標準蛋白質的時間縮短至1.5 h左右(見圖2e),與設計B相比分離時間縮短。然而在實驗的過程中,柱狀的凝膠不便于樣品上樣以及分離結束后對蛋白質條帶進行染色。因此,我們在設計C的基礎上,用平板凝膠代替柱狀凝膠,并在凝膠板之上設置加樣孔(寬4 mm,長1.5 mm),實現(xiàn)垂直加樣,如圖1d所示(設計D)。設計D完全分離標準蛋白質只需要1 h左右,從分離時間和分離之后蛋白質條帶易于染色觀察方面來看,設計D優(yōu)于其他3種設計(見圖2f),設計D的體積也最小,正、負極電泳緩沖溶液共需4 mL,在進行多個樣品測試時可將設計D的多個電泳槽并聯(lián)使用。

在優(yōu)化電泳槽的結構之后,我們對凝膠的長度進行了優(yōu)化。我們將多個設計D的電泳槽并聯(lián)使用,分別裝載不同長度的分離膠,同時對預染蛋白質相對分子質量標準進行分離測試,結果如圖3所示。圖3a的凝膠僅含10%濃度的分離膠,長度為20 mm;圖3b-d的凝膠中含10%濃度分離膠和4%濃度濃縮膠,分離膠的長度分別為15、10和5 mm,濃縮膠長度均為5 mm。對比4種不同長度分離膠的分離結果,可以發(fā)現(xiàn),使用長度為5 mm的分離膠即可將預染蛋白質相對分子質量標準完全分離,雖然各個蛋白質的條帶較緊湊,但能夠區(qū)分所有條帶,且相對分子質量相差較大(如10、50、100 kD)的蛋白質之間的距離較大,足以滿足便攜式現(xiàn)場測試的需求,且整個分離時間最短只需要20 min。

圖 3 水平平板凝膠電泳采用不同長度10%分離膠分離蛋白質Fig. 3 Protein separation on a horizontal slab gel with 10% separation gel of different lengtha. 20 mm; b. 15 mm; c. 10 mm; d. 5 mm.

2.2 電源的優(yōu)化

商業(yè)化凝膠電泳裝置的電源尺寸較大,且需220 V交流電供電,無法便攜式使用。鋰電池尺寸較小,方便攜帶,且可根據需要對電壓進行定制。因此,為了保證安全性,在本研究中我們采用固定工作電壓為25 V的鋰電池作為整個裝置的電源。該鋰電池整體尺寸為70 mm×60 mm×40 mm。在工作電壓為25 V時,該鋰電池可支持同時進行多個電泳槽并聯(lián)使用,且可持續(xù)工作100 h。

2.3 裝置性能的測試

實驗室常用銀染、熒光染色等方法使蛋白質條帶顯色。但這些方法使用試劑較多,步驟繁瑣且耗時較長,無法方便地在戶外進行應用。所以我們采用了一種更便捷的一步染色方法,使蛋白質條帶顯色。該方法只需要使用One-Step BlueTM蛋白質凝膠染料,將分離完成后的蛋白質凝膠浸沒于染液中,即可對分離的蛋白質條帶進行染色(染液對蛋白質進行10～60 min的染色,蛋白質條帶可見即可停止染色)。使用該方法對商用平板凝膠電泳裝置進行標準蛋白質分離染色后,分別采用凝膠成像儀和手機對染色的條帶進行拍攝,結果如圖4a、4b所示。兩種不同拍攝方式得到的蛋白質條帶均清晰可見,說明該染色方法不僅可以在實驗室內用專用實驗設備進行實驗結果的保存,同時也可以在實驗條件不便時用手機對實驗結果進行保存,且成像效果相差無幾。表明該方法可用于現(xiàn)場對蛋白質的分離結果進行觀測。

圖 4 One-Step BlueTM蛋白質顯色效果以及標準蛋白質混合樣品的分離應用Fig. 4 Effect of One-Step BlueTM protein staining and the application of mixed standard protein sample separation a. UMAX PowerLook2100XL-USB shooting; b. mobile phone shooting; c. 15 mm 10% separation gel with UMAX PowerLook2100XL-USB; d. 15 mm 10% separation gel with mobile phone. Standard proteins: carbonic anhydrase (CA), ovalbumin (OVA), bovine serum albumin (BSA), conalbumin (CB), ribonuclease A (RA).

根據之前的實驗結果,5 mm凝膠長度適用于寬相對分子質量范圍的蛋白質分離檢測。對于13～76 kD的窄相對分子質量范圍內的蛋白質,我們采用設計D,裝配包含5 mm 4%濃度濃縮膠和15 mm 10%濃度分離膠的凝膠,對5種標準蛋白質混合溶液樣品進行分析,蛋白質質量濃度0.1 mg/mL,上樣量10 μL。其結果如圖4c、4d所示,使用這種便攜式的凝膠電泳裝置,相對分子質量范圍在13～76 kD的5種標準蛋白質可以在40 min左右分離完成,且染色結果清晰可見,表明此裝置可有效地用于蛋白質的便攜式現(xiàn)場分離和檢測。

該便攜式凝膠電泳裝置與商業(yè)化常規(guī)平板凝膠電泳槽相比,后者所需電泳緩沖溶液約500 mL,分離不同相對分子質量蛋白質標準至少需要4 h。而該便攜式凝膠電泳槽的尺寸僅為15 mm×20 mm×17 mm,需電泳緩沖溶液4 mL左右,分離時間40 min左右,能夠更有效地應用于便攜式檢測的場景中。

3 結論

本研究設計加工了一種便攜式凝膠電泳裝置。該裝置具有尺寸及容積小、電泳緩沖液用量少、分離快速、便攜等特點,可用于蛋白質的現(xiàn)場分析和檢測。值得注意的是,本系統(tǒng)可以多個電泳槽并聯(lián)使用,同時分析更多樣品。與商用平板凝膠電泳相比,本實驗裝置優(yōu)勢在于:(1)采用鋰電池替代常規(guī)220 V電源,可用于戶外檢測;(2)分析相同的預染蛋白質所需時間更短,且分離效果相當;(3)作為核心分離單元的水平平板凝膠電泳裝置主要采用3D打印技術制作,方便快捷,成本低廉。3D打印作為實驗室研發(fā)手段,可基于數字化的原型將所研發(fā)的儀器組件進行快速修改和優(yōu)化,并在實驗室內部或實驗室之間實現(xiàn)低成本、快速、精確的制造和復制,這也凸顯了3D打印對于小型分析儀器開發(fā)的強大優(yōu)勢和應用前景。隨著3D打印機精度、材料替代品的增加,越來越多的實驗裝置可通過3D打印技術實現(xiàn)微型化和便攜化。