加壓毛細(xì)管電色譜法高效分離分析葛根多糖中的單糖

許歆瑤, Soumia CHEDDAH, 王 彥, 閻 超

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200240)

葛根為豆科植物野葛PuerariaLobate(Willd.)ohwi的干燥根,其產(chǎn)地較廣,資源豐富,可分為粉葛(PuerariathomsoniiBenth)和柴葛(PuerarialobataOhwi)兩種[1,2],粉葛為豆科植物甘葛藤的干燥根;柴葛習(xí)稱野葛,為豆科植物野葛的干燥根。富含異黃酮類、多糖類、氨基酸及微量元素等物質(zhì),具有營(yíng)養(yǎng)保健功效和突出的藥用價(jià)值,故享有“南方人參”的美譽(yù),其有效成分在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定性、保護(hù)腦神經(jīng)、抗氧化、防止肝腎損傷、改善代謝與免疫功能等方面均有一定的藥理作用[3-5]。但目前大多研究主要關(guān)注葛根素及總黃酮成分,對(duì)葛根多糖研究較少[6,7]。糖類物質(zhì)由于沒(méi)有紫外吸收,并且具有很強(qiáng)的極性,所以難以直接分離檢測(cè)。近年來(lái)對(duì)植物多糖中單糖分析檢測(cè)的方法主要包括衍生化的液相色譜法[8,9]、親水作用色譜[10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[11,12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[13-15]及近年發(fā)展起來(lái)的離子色譜法[16,17]等,對(duì)枸杞多糖、葛根多糖、鹿茸多糖等中藥多糖的單糖組成進(jìn)行了測(cè)定,這些方法存在衍生操作較為繁瑣、分離柱效欠佳、質(zhì)譜檢測(cè)器價(jià)格高昂等不足。多糖中單糖組成及含量不同可能導(dǎo)致多糖空間結(jié)構(gòu)不同,從而導(dǎo)致生物活性不同,因此,對(duì)葛根多糖進(jìn)行提取并測(cè)定葛根多糖的單糖組成對(duì)其活性分析和質(zhì)量控制具有重要意義。

加壓毛細(xì)管電色譜(pressurized capillary electrochromatography, pCEC)是一種結(jié)合了毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)和毛細(xì)管液相色譜(capillary liquid chromatography, cLC)優(yōu)點(diǎn)的高效電動(dòng)微分離技術(shù)。pCEC兼具CE和cLC的雙重分離機(jī)理,既可以分離中性物質(zhì)也可分離帶電物質(zhì),同時(shí)又具備高柱效、高分辨率、高選擇性和快速分離等優(yōu)點(diǎn)[18]。目前,尚未有利用加壓毛細(xì)管電色譜法同時(shí)分離葡萄糖(glucose, Glc)、鼠李糖(rhamnose, Rha)、甘露糖(mannose, Man)、阿拉伯糖(arabinose, Ara)、半乳糖(galactose, Gal)、核糖(ribose, Rib)、木糖(xylose, Xyl)和巖藻糖(fucose, Fuc) 8種中性單糖并應(yīng)用于葛根多糖單糖組成鑒定的報(bào)道。

本研究利用提取時(shí)間短、提取效率高、操作簡(jiǎn)便的超聲提取法提取葛根多糖,并利用響應(yīng)面分析法對(duì)提取條件進(jìn)行探索優(yōu)化;利用改善的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生法,建立加壓毛細(xì)管電色譜-紫外檢測(cè)器新方法探索多種中性單糖的分離,優(yōu)化分離條件,實(shí)現(xiàn)單糖的快速高效分離檢測(cè),并對(duì)中藥葛根實(shí)際樣品的單糖組成成分進(jìn)行探究與分析,為單糖化合物的分離檢測(cè)提供新方法并為葛根多糖的單糖組成提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TriSepTM2100加壓毛細(xì)管電色譜儀,包括柱上紫外檢測(cè)器、微流控系統(tǒng)、溶劑輸送系統(tǒng)、高壓電源和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(美國(guó)Unimicro Technologies公司); KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司); SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海大顏儀器設(shè)備有限公司); RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠); DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); Milli-Q純凈水儀(德國(guó)默克密理博公司)。

D(+)-巖藻糖(純度>98%)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(純度>99%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;D(+)-甘露糖(純度>99%)、D(+)半乳糖(純度>98%)購(gòu)自Alfa Aesar(阿法埃莎)中國(guó)化學(xué)有限公司;D(+)葡萄糖分析對(duì)照品(純度>99%)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;D(+)木糖(純度>98%)購(gòu)自上海迪柏生物科技有限公司;L(+)鼠李糖(純度>98%)購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司;D-阿拉伯糖(純度>98%)購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;D-核糖(純度>99%)購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司。乙腈、氨水、乙酸、三氯甲烷、三氟乙酸(TFA)、石油醚、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。粉葛根飲片購(gòu)于河北紐恩堂有限公司(藥材原產(chǎn)地:湖南),柴葛根茶飲片購(gòu)于神農(nóng)金康公司(藥材原產(chǎn)地:湖南)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化

1.2.1試劑配制

衍生化試劑:精密稱取PMP 0.870 g,置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容,搖勻,制得0.5 mol/L的衍生化試劑PMP甲醇溶液,保存于4 ℃冰箱備用。

標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液:準(zhǔn)確稱取甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于5 mL容量瓶中,加氨水溶解并定容,搖勻,制得2 g/L的8種單糖對(duì)照品堿性混合溶液,保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的衍生化

取200 μL 2 g/L 8種單糖混合溶液于反應(yīng)管中,加入200 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液,封蓋,在70 ℃反應(yīng)100 min,反應(yīng)結(jié)束置室溫冷卻后,真空干燥除氨,再加入2 mL三氯甲烷,充分振蕩,于3 000 r/min離心5 min,棄去有機(jī)相,除去過(guò)量的衍生試劑,重復(fù)萃取操作3次后,取水相過(guò)0.22 μm濾膜后適當(dāng)稀釋,待進(jìn)樣分析。

1.3 樣品制備

1.3.1葛根多糖的超聲提取

稱取適量葛根樣品加5倍量石油醚在80 ℃下回流2 h,脫脂后過(guò)濾,干燥備用[19];稱取每份10 g葛根樣品,按照一定液料比(粉葛多糖液料比20 mL/g,柴葛多糖液料比40 mL/g)、超聲溫度90 ℃、超聲時(shí)間30 min、超聲功率180 W進(jìn)行超聲提取;抽濾,濾液濃縮后,加入l/5體積Sevage試劑(氯仿-正丁醇,體積比為4∶1)除蛋白,后加入4倍體積的無(wú)水乙醇使多糖沉淀,4 ℃靜置過(guò)夜,抽濾得沉淀,真空干燥后得到葛根多糖[20,21]。

1.3.2葛根多糖的水解

準(zhǔn)確稱取超聲提取后的粉葛和柴葛多糖樣品各5 mg置于圓底燒瓶中,加入2 mol/L TFA溶液2 mL, 120 ℃條件下水解2 h,冷卻后加甲醇旋干除去TFA,重復(fù)3次至中性,加入1 mL超純水溶解后得到多糖水解液。

1.3.3葛根多糖水解樣品衍生

取2種多糖水解液各200 μL于反應(yīng)管中,加入200 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和800 μL氨水,同1.2.2節(jié)衍生方法進(jìn)行PMP衍生化和后續(xù)處理,得到多糖水解衍生物,過(guò)0.22 μm濾膜后,待進(jìn)樣分析。

1.4 pCEC-UV分離單糖色譜條件

色譜柱:C18核殼型Halo柱(20 cm×100 μm, 2.7 μm,蘇州環(huán)球色譜有限責(zé)任公司);流動(dòng)相為乙腈-50 mmol/L pH 4.1的醋酸銨水溶液(18∶82, v/v);流速0.1 mL/min;施加電壓-20 kV;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;進(jìn)樣量5 μL;毛細(xì)管電色譜實(shí)際分流比1∶400。

1.5 提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,以液料比(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲溫度(C)和超聲功率(D)為考察變量,以葛根多糖粗提率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平見表1。

表 1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 pCEC分離條件的探索優(yōu)化

選用8種單糖衍生物為分離對(duì)象,以pCEC-UV分離模式為平臺(tái),探究?jī)?yōu)化的衍生方法、緩沖鹽濃度、緩沖鹽pH、施加電壓、毛細(xì)管色譜柱填料及流動(dòng)相比例對(duì)分離單糖衍生物的影響。

2.1.1衍生化方法優(yōu)化

依據(jù)傳統(tǒng)方法[22-24],通常用NaOH提供衍生反應(yīng)的堿性條件,反應(yīng)過(guò)后需加入HCl進(jìn)行中和。本研究利用該法進(jìn)行的前期試驗(yàn)表明,由于毛細(xì)管電色譜分離時(shí),毛細(xì)管內(nèi)部容積小至幾微升,分離易受樣品基質(zhì)輕微變化的影響,傳統(tǒng)方法處理所得樣品含有較高濃度NaCl(通常為0.3 mol/L),易造成毛細(xì)管入口處洗脫液組成的不規(guī)則變化[25],實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)管柱堵塞、加電困難,從而使分離效果不佳且柱效低。后嘗試將單糖直接溶解在氨水中,反應(yīng)后真空干燥除氨,從而解決傳統(tǒng)衍生方法中NaCl對(duì)pCEC分離單糖的影響并簡(jiǎn)化了操作。

2.1.2緩沖鹽濃度對(duì)分離的影響

首先用3 μm C18柱在加壓-22 kV、緩沖鹽pH 4.9條件下,用10、25、50、100 mmol/L的醋酸銨緩沖液作為水相對(duì)8種單糖衍生物進(jìn)行分離。結(jié)果表明,緩沖鹽濃度對(duì)物質(zhì)的保留時(shí)間有較大影響,緩沖鹽濃度較低時(shí),物質(zhì)電泳效果較差,保留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)近1 h,且核糖與鼠李糖、阿拉伯糖與木糖無(wú)法分離。當(dāng)濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí),分離時(shí)間縮短到20 min內(nèi),且核糖與鼠李糖實(shí)現(xiàn)完全分離,阿拉伯糖與木糖分離度增加。當(dāng)濃度為100 mmol/L時(shí),由于產(chǎn)生的電流過(guò)大,無(wú)法形成穩(wěn)定的基線。故選擇50 mmol/L的緩沖液。

2.1.3緩沖鹽pH對(duì)分離的影響

在加壓-22 kV、緩沖鹽濃度50 mmol/L條件下,用pH 5.5、4.9、4.1和3.7的醋酸銨緩沖液對(duì)8種單糖衍生物進(jìn)行分離。結(jié)果表明,當(dāng)pH降低時(shí),由于在酸性條件下物質(zhì)帶電及電泳效果增強(qiáng),保留時(shí)間縮短,阿拉伯糖和木糖分離度增加,葡萄糖和半乳糖分離度降低,其余分離度無(wú)顯著變化。根據(jù)分離情況選擇pH 4.1。

2.1.4施加電壓對(duì)分離的影響

分別在cLC (0 kV)和pCEC (-15 kV到-22 kV)模式下對(duì)8種單糖衍生物進(jìn)行分離。結(jié)果表明,cLC條件下約100 min全部出峰,pCEC -22 kV時(shí)可將分離時(shí)間縮短到20 min內(nèi),相比傳統(tǒng)LC方法對(duì)單糖的分離[23,24,26,27],顯著縮短了分離時(shí)間;且柱塞型電滲流驅(qū)動(dòng)力和拋物線型壓力流驅(qū)動(dòng)力聯(lián)合驅(qū)動(dòng)樣品的分離,大大提高柱效及分離度,不加電時(shí)無(wú)法分離的核糖和鼠李糖在-20 kV時(shí)達(dá)到完全分離。綜合考慮,選擇-20 kV為分離電壓。

2.1.5色譜柱填料對(duì)分離的影響

在-20 kV條件下,分別利用3 μm、1.7 μm及2.7 μm的核殼型Halo顆粒填充的C18柱(均來(lái)自蘇州環(huán)球色譜有限責(zé)任公司)對(duì)8種單糖衍生物進(jìn)行分離。結(jié)果表明,采用3 μm C18柱時(shí),27 min左右全部出峰,除葡萄糖和半乳糖、阿拉伯糖和木糖兩組同分異構(gòu)體沒(méi)有完全分離,其余單糖均實(shí)現(xiàn)分離;采用新型2.7 μm Halo核殼型填料的C18柱時(shí),柱效提高,峰形改善,所有單糖均達(dá)到基本分離,24 min全部出峰;采用1.7 μm C18柱時(shí),各峰分離度進(jìn)一步提高,所有單糖均達(dá)到完全分離,但由于填料粒徑小,反壓大,保留時(shí)間大大延長(zhǎng)至75 min左右。綜合考慮,選擇2.7 μm Halo核殼型填料的C18柱來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

2.1.6流動(dòng)相對(duì)分離的影響

選擇2.7 μm C18核殼型Halo柱,在-20 kV條件下,分別用20∶80、18∶82和16∶84的乙腈-醋酸銨的流動(dòng)相對(duì)8種單糖衍生物進(jìn)行分離。結(jié)果表明,有機(jī)相比例降低,單糖分離度提高,保留時(shí)間延長(zhǎng);有機(jī)相比例增大加快洗脫,葡萄糖與半乳糖無(wú)法分離;綜合考慮,選擇乙腈-醋酸銨之比為18∶82,此時(shí)兩組同分異構(gòu)體分離度為1.3,達(dá)到基本分離。

表 2 8種單糖的線性關(guān)系、重復(fù)性和檢出限、定量限分析結(jié)果

2.1.7色譜條件的確定

綜上所述,經(jīng)過(guò)條件探索與優(yōu)化,選擇Halo-2.7 μm核殼型C18毛細(xì)管色譜柱,流動(dòng)相為乙腈-醋酸銨(18∶82, v/v,其中醋酸銨濃度50 mmol/L, pH 4.1),加壓-20 kV,如圖1所示,在24 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了8種單糖衍生物的分離。

圖 1 8種單糖衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)品的pCEC分離色譜圖Fig. 1 pCEC chromatogram of a mixture of the eight monosaccharide derivatives Column: C18-Halo (20 cm×100 μm, 2.7 μm); mobile phases: ACN-50 mmol/L pH 4.1 ammonium acetate (18∶82, v/v); flow rate: 0.1 mL/min; split ratio: 1∶400; detection wavelength: 250 nm; applied voltage: -20 kV. Peak identifications: PMP. 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone; 1. mannose, Man; 2. ribose, Rib; 3. rhamnose, Rha; 4. glucose, Glc; 5. galactose, Gal; 6. xylose, Xyl; 7. arabinose, Ara; 8. fucose, Fuc.

2.2 方法驗(yàn)證

分別將0.30、0.20、0.15、0.12以及0.10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液,按照1. 2. 2節(jié)方法進(jìn)行衍生,并按照1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測(cè),各濃度下8種單糖重復(fù)測(cè)定3次。將峰面積平均值y對(duì)單糖質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性回歸得到線性方程及相關(guān)系數(shù)(r2);按色譜圖中信噪比(S/N)=3,得到檢出限(LOD);按S/N=10,得到定量限(LOQ);選擇0.30 g/L的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液進(jìn)樣6次,記錄8種單糖PMP衍生物的保留時(shí)間及峰面積,計(jì)算RSD,考察精密度。結(jié)果(見表2)表明該方法測(cè)定8種單糖具有較好的線性關(guān)系和良好的重復(fù)性。可用于樣品中游離單糖或多糖的單糖組成測(cè)定。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

超聲輔助提取法因其提取時(shí)間短,效率較高,在合適的功率下對(duì)提取物破壞小,與傳統(tǒng)的浸提方法相比具有較多優(yōu)勢(shì)[27,28],因而被廣泛應(yīng)用于有效成分的提取。已有較多研究證明,在超聲輔助提取過(guò)程中,液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間及超聲功率均對(duì)提取率有所影響[20]。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合,分別建立了粉葛多糖和柴葛多糖的提取工藝參數(shù)回歸模型。

表 3 粉葛多糖和柴葛多糖提取響應(yīng)面方差分析結(jié)果

粉葛多糖的提取率回歸方程為:Extraction rate=9.81+0.44A-0.008 314B+1.68C+0.35D-0.028AB+0.017AC-0.15AD-1.25BC-1.18BD-0.20CD-0.35A2-0.82B2-0.19C2-1.27D2;柴葛多糖的提取率回歸方程為:Extraction rate=6.94+0.27A+0.059B+0.93C+0.22D-0.021AB+0.10AC+0.062AD-0.33BC-0.50BD-0.047CD-0.002 385A2-0.45B2-0.20C2-0.65D2。

圖 2 四因素交互影響粉葛多糖提取率的響應(yīng)面三維圖Fig. 2 Response surface 3D plots of the extraction rate of Pueraria thomsonii a. time (B) and liquid/solid ratio (A); b. temperature (C) and liquid/solid ratio (A); c. power (D) and liquid/solid ratio (A); d. temperature (C) and time (B); e. power (D) and time (B); f. power (D) and temperature (C).

圖 3 四因素交互影響柴葛多糖提取率的響應(yīng)面三維圖Fig. 3 Response surface 3D plots of the extraction rate of Pueraria lobata OhwiFor a-f, see Fig. 2.

粉葛多糖和柴葛多糖的超聲輔助提取響應(yīng)面方差分析結(jié)果見表3。由方差分析結(jié)果可知,兩個(gè)模型的p值都達(dá)到了極顯著水平,失擬項(xiàng)均大于0.05,說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著,所建立的回歸模型能充分反應(yīng)實(shí)際情況。回歸模型的總決定系數(shù)(R2)為0.977 4和0.936 8,說(shuō)明葛根多糖的提取率與模型預(yù)測(cè)結(jié)果有良好的一致性。由F檢驗(yàn)值可知,A液料比、B時(shí)間、C溫度和D功率4項(xiàng)對(duì)兩種葛根多糖提取率的影響大小順序?yàn)?C>A>D>B,即超聲溫度對(duì)得率影響最大,其次為液料比、超聲功率和時(shí)間,對(duì)粉葛多糖:時(shí)間的影響不顯著,模型中的交互項(xiàng)BC和BD、二次項(xiàng)B2和D2都達(dá)到了極顯著水平;對(duì)柴葛多糖:功率和時(shí)間的影響不顯著,模型中僅有二次項(xiàng)B2和D2達(dá)到了顯著水平。

四因素交互對(duì)兩種葛根多糖提取率的響應(yīng)面三維圖如圖2和圖3所示,對(duì)4個(gè)因素兩兩交互作用進(jìn)行分析,交互曲面的陡峭程度及等值線的橢圓程度可以反映因素影響及交互效應(yīng)的強(qiáng)弱[29]。圖2d和圖2e中曲面較為陡峭且等值線橢圓程度高,表明時(shí)間和溫度、時(shí)間和功率兩組因素交互作用強(qiáng),與粉葛多糖的方差分析結(jié)果一致。圖3中等值線橢圓程度比圖2中小,表明柴葛多糖提取率受四因素交互影響較粉葛多糖相對(duì)不顯著。

結(jié)合軟件預(yù)測(cè)分析得到的最佳條件及設(shè)備實(shí)際情況,確定葛根多糖的最佳提取工藝條件為:粉葛多糖液料比20 mL/g,柴葛多糖液料比40 mL/g,超聲溫度90 ℃,超聲時(shí)間30 min,超聲功率180 W。以此條件對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行多糖提取。

2.4 葛根實(shí)際樣品單糖組成的pCEC分析

應(yīng)用所建立的加壓毛細(xì)管電色譜法,對(duì)2種葛根樣品的單糖組成進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果見圖4。將實(shí)際樣品譜圖與圖1對(duì)應(yīng)可知:粉葛(見圖4a)主要由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和巖藻糖組成,根據(jù)峰面積計(jì)算得到4種單糖物質(zhì)的量之比為0.16 (Man)∶0.14 (Rha)∶1.00 (Glc)∶0.07 (Fuc);柴葛(見圖4b)主要由葡萄糖和甘露糖組成,2種單糖物質(zhì)的量之比為0.70 (Man)∶1.00 (Glc)。實(shí)際樣品的單糖組成測(cè)定結(jié)果與趙丹等[17]報(bào)道的離子色譜方法測(cè)定的葛根樣品中巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖的結(jié)果大致相符,與周禮仕等[9]報(bào)道的不同產(chǎn)地的葛根多糖單糖組成結(jié)果有所差異,判斷可能由于葛根產(chǎn)地不同而導(dǎo)致單糖組成差異。

圖 4 葛根多糖水解液衍生物的pCEC分離圖Fig. 4 pCEC chromatograms of hydrolyzed derivatives of actual polysaccharide samplesa. Pueraria thomsonii Benth; b. Pueraria lobata Ohwi.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)葛根多糖超聲提取法中液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間和超聲功率進(jìn)行了工藝探究,研究了4個(gè)因素對(duì)葛根多糖提取率的影響,建立了柱前衍生加壓毛細(xì)管電色譜測(cè)定8種中性單糖的新方法,對(duì)該法中緩沖鹽濃度、緩沖鹽pH、施加電壓、色譜柱以及流動(dòng)相比例進(jìn)行了探索與優(yōu)化,并對(duì)葛根多糖樣品的單糖組成進(jìn)行了分析與測(cè)定。本方法簡(jiǎn)單、快速、分離效果好、柱效高,可作為樣品中游離單糖或多糖的單糖組成測(cè)定的新方法。