14株鴨疫里默氏桿菌的部分生物學(xué)特性分析

左春生 李迎曉 徐光科

摘要：為了解鴨疫里默氏桿菌的流行情況，對信陽地區(qū)疑似鴨疫里默氏桿菌感染病料進(jìn)行病原分離和鑒定。結(jié)果顯示，共鑒定到14株鴨疫里默氏桿菌，其中血清1型、2型和10型菌株依次為3、4、2株，未定血清型菌株5株;動物致病性試驗結(jié)果顯示，分離菌對雛鴨均具有致病性。對11種抗菌藥物敏感性檢測結(jié)果表明，分離菌株對阿米卡星、鏈霉素和頭孢曲松較為敏感，對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B和多西環(huán)素耐藥性較高;生物被膜檢測結(jié)果表明，14株菌株中有8株為強(qiáng)生物被膜形成株，2株為弱生物被膜形成株。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;分離鑒定;血清型;藥敏試驗;生物被膜

中圖分類號： S855.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0221-05

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，是目前規(guī)?；蒺B(yǎng)殖多發(fā)的細(xì)菌性疾病，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鴨疫里默氏桿菌主要侵害2～7周齡的雛鴨和仔鵝，特征性病變?yōu)槔w維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、關(guān)節(jié)炎、輸卵管炎和腦膜炎等[1]。

我國郭玉璞等在1982年首次報道北京地區(qū)商品鴨發(fā)生鴨傳染性漿膜炎后[2]，其他主要水禽養(yǎng)殖區(qū)域陸續(xù)報道發(fā)現(xiàn)該病。鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，至少有21個血清型，且各型之間幾乎無交叉保護(hù)性，已成為危害養(yǎng)鴨生產(chǎn)的主要疾病[3]。信陽市是河南省主要的水禽集散地，部分養(yǎng)殖戶使用血清1型和血清2型RA滅活疫苗免疫后，預(yù)防效果不佳。因此，本研究通過對實驗室送檢的疑似鴨疫里默氏桿菌感染病料進(jìn)行細(xì)菌分離和血清型鑒定，旨在為河南省信陽市水禽鴨疫里默氏桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品為養(yǎng)殖戶送檢的發(fā)病雛鴨。

1.2 主要試劑與試驗動物

胰蛋白胨大豆（TSA）瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑有限公司;即用型SanPfu PCR試劑盒、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司;鴨疫里氏桿菌1型、2型菌株和RA標(biāo)準(zhǔn)血清由上海獸醫(yī)研究所胡青海博士惠贈;1日齡健康非免疫櫻桃谷鴨，購自河南華英農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司，隔離飼養(yǎng)至15日齡后用于細(xì)菌致病性試驗測定。

1.3 細(xì)菌學(xué)檢查

無菌采集病死雛鴨肝臟、腦等病料，劃線接種于TSA平板，置于燭缸中37 ℃培養(yǎng)36～48 h，挑取可疑菌落轉(zhuǎn)接種TSA培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）純培養(yǎng)后，革蘭氏染色和瑞氏染色后檢查細(xì)菌形態(tài)。挑取TSA培養(yǎng)基純化后的單菌落轉(zhuǎn)接種TSB培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）增菌培養(yǎng)后待用。

1.4 生化試驗

參照文獻(xiàn)[4]方法，取TSA培養(yǎng)基上純化的單菌落接種細(xì)菌生化反應(yīng)管，37 ℃培養(yǎng)規(guī)定時間后觀察并記錄結(jié)果。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 細(xì)菌基因組的提取 挑取單菌落接種5 mL TSB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振搖培養(yǎng)過夜。取 500～1 000 μL進(jìn)行細(xì)菌基因組提取，操作步驟按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 16S rRNA基因和dan B基因PCR檢測 根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法，設(shè)計檢測RA 16S rRNA基因和dan B基因的2對引物，擴(kuò)增片段長度分別為364、627 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物詳情見表1。

PCR反應(yīng)體系50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，超純水19 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸 5 min。

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析比對。

1.6 血清型鑒定

參照程安春等的方法[6]，將各RA分離株菌液和RA1、RA2、RA10型標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行平板凝集試驗，觀察記錄結(jié)果。

1.7 動物致病性試驗

參照任小梅等的方法[4]，將鑒定后的14株RA分離株分別腿部肌肉注射進(jìn)15日齡的櫻桃谷鴨或麻鴨，注射劑量為0.5 mL/羽（約1×108 CFU），每組3羽，同時設(shè)立對照組，腹腔注射0.5 mL滅菌生理鹽水。攻毒后每天觀察并記錄各組發(fā)病、死亡情況。

1.8 藥敏試驗

以大腸埃希菌（ATCC 25922）作為質(zhì)控菌株，參照CLSI推薦的藥敏試驗紙片擴(kuò)散法測定14株供試菌株對11種抗菌藥物的耐藥表型。結(jié)果依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定各分離菌株的敏感性，以敏感、中介、耐藥3種形式記錄[7]。

1.9 鴨疫里默氏桿菌的生物被膜檢測

參照文獻(xiàn)的方法[8]將14株鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌DH5a的新鮮菌液（D600 nm=1.0）采用TSB進(jìn)行1 ∶ 100稀釋后，加入96孔板，200 μL/孔，每株細(xì)菌設(shè)3個重復(fù)，然后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后采用結(jié)晶紫染色法檢測其生物被膜形成情況。最后采用酶標(biāo)儀檢測各孔D595 nm值。生物被膜形成能力的判定標(biāo)準(zhǔn)為D595 nm≤0.31為無生物被膜形成菌株;0.31

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離與染色

從58份病料中分離出14株RA，分離株在TSA培養(yǎng)基上，于燭缸中37 ℃培養(yǎng)24～36 h后，可形成圓形、略微突起、表面光滑的奶油狀小菌落（對著光線觀察菌落呈現(xiàn)淡藍(lán)色）。革蘭氏染色鏡檢可見散在或少數(shù)成對出現(xiàn)的革蘭陰性短桿（球桿）菌;瑞氏染色呈兩極濃染，符合RA的形態(tài)特征。

2.2 生化試驗結(jié)果

14株RA乳糖發(fā)酵試驗、半乳糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗、VP試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、硝酸鹽還原試驗和枸櫞酸鹽試驗均為陰性，不產(chǎn)生硫化氫，氧化酶試驗、觸酶試驗均為陽性，基本符合RA的生化特性。

2.3 16S rRNA基因和dan B基因PCR檢測結(jié)果

14株RA均能PCR擴(kuò)增出約364、627 bp大小的條帶，與預(yù)期相符（圖1、圖2）。將陽性條帶切膠回收后測序，結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶的序列與目的基因序列高度一致。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

將分離到的14株細(xì)菌分別與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行平板凝集試驗。由表2可知，血清1型菌株3株、血清2型菌株4株、血清10型菌株2株， 其他菌株為未定血清型。

2.5 動物致病性試驗結(jié)果

試驗組櫻桃谷雛鴨接菌后18～24 h出現(xiàn)精神委頓、呆立，逐漸排出白色、黃白色、黃綠色稀糞，2～3 d后開始出現(xiàn)死亡，并在死亡前表現(xiàn)出陣發(fā)性搖頭、勾頭扭頸等臨床癥狀。剖檢死鴨有輕或重的纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎和腦膜炎。對死亡鴨進(jìn)行細(xì)菌分離和PCR鑒定，結(jié)果能夠重新分離鑒定出接種菌。

2.6 14株鴨疫里默氏桿菌對11種抗菌藥物的耐藥表型

由表3可知，14株鴨疫里默氏桿菌對11種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B、多西環(huán)素耐藥率較高，分別為100%（14/14）、100%（14/14）、85.72%（12/14）、85.72%（12/14）和78.58%（11/14）;對阿米卡星、鏈霉素和頭孢曲松敏感性較高，分別為92.86%（13/14）、64.28%（9/14）和57.14%（8/14）;多數(shù)菌株呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象（表2）。

2.7 分離株的生物被膜檢測

生物被膜檢測結(jié)果顯示，8株（PQJ4、PQY2、PQH5、LSG1、GSX6、HY8、HB1和HCH7）具有強(qiáng)生物被膜形成能力;GSP5和HY1為弱生物被膜形成能力，具體結(jié)果見表2。

3 結(jié)論與討論

信陽市水資源豐富，除采用標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖體系的櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖龍頭——河南華英農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司外，還有眾多小型養(yǎng)殖戶和散養(yǎng)戶。這些小型養(yǎng)殖戶和散養(yǎng)戶的鴨（鵝）苗來源比較雜，除本地的孵化場外，其他大多來源于江蘇、安徽、四川和廣東（獅頭鵝）等地，使得信陽地區(qū)鴨疫里默氏桿菌血清型分布較為多樣，再加上呼腸孤病毒感染的普遍存在[9-10]，使得鴨疫里默氏桿菌病的防控形勢更加嚴(yán)峻。

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，并且存在明顯的區(qū)域性特征。任曉梅等從廣東、山東、江蘇等地區(qū)疑似鴨疫里默氏桿菌病病料中分離鑒定出46株鴨疫里默氏桿菌，其中血清1型、2型、10型和15型菌株依次為9株、25株、1株和1株，未定血清型菌株10株[4]。云水麗等從江蘇省某免疫鴨場的病死鴨中分離到了血清11型的鴨疫里默氏桿菌[11]。袁小遠(yuǎn)等2015—2016年間從山東及河北等地的商品鴨場病料中共分離出18株鴨疫里默氏桿菌，均為血清1型RA[12]。本研究分離的14株鴨疫里默氏桿菌中血清1型菌株3株，血清2型菌株4株，血清10型2株，其他菌株為未定血清型，這與焦鳳超等的早期研究結(jié)果部分吻合[13]，這也解釋了為什么當(dāng)前信陽地區(qū)很多養(yǎng)殖戶雖然實施了鴨疫里默氏桿菌病疫苗（主要是血清1型和2型）的免疫接種，但該病仍頻繁發(fā)生的原因。

由于鴨疫里默氏桿菌病疫苗免疫預(yù)防效果不佳，所以很多養(yǎng)殖戶往往采用抗菌藥物進(jìn)行防治，而鴨疫里默氏桿菌又經(jīng)常和大腸桿菌發(fā)生混合感染，這給該菌的分離鑒定帶來一定的難度。本研究參考丁云竹等建立的PCR方法輔助開展鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定，提高了工作效率[5]。另外Hu等建立的針對大腸桿菌phoA、沙門菌invA、鴨疫里默氏桿菌dna B基因的三重PCR方法，其檢測下限為1×103 CFU/mL[14]。Wei等建立的大腸桿菌、沙門菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、多重PCR檢測方法，其檢測下限為10 pg基因組DNA[15]。以上這些方法有助于對臨床病料中的鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行鑒別檢測。

報道表明，RA對多種抗生素表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象[16]。荊雅瑋等對分離自安徽省的8株RA菌株藥物敏感性檢測結(jié)果表明，RA對阿莫西林、頭孢他啶和頭孢吡啶敏感，對洛美沙星和阿奇霉素、阿米卡星耐藥[17]。Zhong等對國內(nèi)分離的224株RA進(jìn)行耐藥性檢測的結(jié)果表明，50%的分離株對β-內(nèi)酰胺類抗生素、利福平等多種抗生素耐藥，其中有4株對29種抗生素耐藥[18]。本次分離的14株RA對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異唑、多黏菌素B和多西環(huán)素表現(xiàn)出較高的耐藥率以及多重耐藥現(xiàn)象，但對阿米卡星敏感性較好，為92.86%（13/14），與上述結(jié)果有較大出入，這可能與各地用藥習(xí)慣有關(guān)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，信陽地區(qū)使用抗菌藥物防治鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病時，主要采用拌料或飲水給藥，且常使用氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、多黏菌素B和磺胺類等藥物，很少用阿米卡星和頭孢類藥物，這與14株RA的耐藥性檢測結(jié)果基本相符。

生物膜是一個微生物群落，由細(xì)胞外聚合物基質(zhì)包圍的微生物組成。研究報道鴨疫里默氏桿菌形成生物被膜能力可能和該菌在養(yǎng)殖環(huán)境中的持續(xù)存在和細(xì)菌耐藥性存在一定的關(guān)系[8，19]。荊雅瑋等分離的8株菌株中有7株為強(qiáng)生物被膜形成株，且表明強(qiáng)生物被膜形成株AH-1對17種抗菌藥物耐藥[17]。本研究分離的14株RA中有8株為強(qiáng)生物被膜形成株，并且8株均表現(xiàn)出了多種耐藥現(xiàn)象，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究確定。

綜上所述，本研究從58份臨床送檢病料中分離到14株疑似鴨疫里默氏桿菌，通過細(xì)菌生物學(xué)特性和16S rRNA基因、dan B基因PCR鑒定，確定分離菌株為鴨疫里默氏桿菌，并對其部分生物特性如血清型、耐藥表型和生物被膜形成能力進(jìn)行了鑒定，為河南省信陽市的水禽鴨疫里默氏桿菌病的綜合防控提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘇敬良，黃 瑜，胡薛英. 鴨病學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2016：243-245.

[2]郭玉璞，陳德威，范國雄，等. 北京鴨小鴨傳染性漿膜炎的調(diào)查研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1982，13（2）：35-41.

[3]吳彩艷，程淑琴，張建峰，等. 我國鴨疫里氏桿菌病流行概述[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，38（6）：86-90.

[4]任曉梅，王小蘭，韓文龍，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究[J]. 中國動物傳染病學(xué)報，2018，26（4）：47-51.

[5]丁云竹，孫冰清，姜 盼，等. 鴨疫里默氏桿菌16S rRNA和dna B基因的雙重PCR檢測方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2017，39（1）：50-53.

[6]程安春，汪銘書，陳孝躍，等. 我國鴨疫里默氏桿菌血清型調(diào)查及新血清型的發(fā)現(xiàn)和病原特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，23（4）：320-323.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twenty fourth informational supplement[S]. CLSI documents M100-S24，CLSI，2014.

[8]Hu Q H，Han X G，Zhou X J，et al. Characterization of biofilm formation by riemerella anatipestifer[J]. Vet Microbiol，2010，144（3/4）：429-436.

[9]黃 瑜，蘇敬良，施少華，等. 我國鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的疫病[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2009，45（7）：57-58，92.

[10]高緒慧，吳海洋，孫吉謙，等. 山東地區(qū)新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J]. 中國家禽，2018，40（20）：61-63.

[11]云水麗，楊 勇，王小波，等. 11型鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及致病性研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31（8）：605-609.

[12]袁小遠(yuǎn)，王友令，王曉麗，等. 2015—2016年山東、河北地區(qū)鴨疫里默氏桿菌流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國家禽，2017，39（4）：70-72.

[13]焦鳳超，李迎曉，陳宏智，等. 河南省信陽市鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定和血清型分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：166-167.

[14]Hu Q H，Tu J，Han X G，et al. Development of multiplex PCR assay for rapid detection of Riemerella anatipestifer，Escherichia coli，and Salmonella enterica simultaneously from ducks[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，87（1）：64-69.

[15]Wei B，Cha S Y，Kang M，et al. Development and application of a multiplex PCR assay for rapid detection of 4 major bacterial pathogens in ducks[J]. Poultry Science，2013，92（5）：1164-1170.

[16]劉馬峰，田 琇，程安春. 鴨疫里默氏桿菌毒力及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報，2019（7）：1222-1231.

[17]荊雅瑋，陳芳芳，左佳坤，等. 8株鴨疫里默氏桿菌安徽分離株的生物學(xué)特性分析[J]. 中國動物傳染病學(xué)報，2018，26（2）：34-39.

[18]Zhong C Y，Cheng A C，Wang M S，et al. Antibiotic susceptibility of riemerella anatipestifer field isolates[J]. Avian Diseases，2009，53（4）：601-607.

[19]Burmolle M，Webb J S，Rao D，et al. Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in multispecies biofilms[J]. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（6）：3916-3923.