一株Coniella屬真菌的分離培養(yǎng)鑒定及抑菌活性實(shí)驗(yàn)

張志博 張亞男 張笑 劉麗菲 贠娜娜 田慧敏

摘 要：從赤芍（Paeonia lactiflora Pall）植株根部分離到一株內(nèi)生真菌（編號(hào)Gen7）.該菌菌絲無(wú)色，具隔膜，分生孢子梗短或無(wú)，分生孢子橢圓形初為無(wú)色，后為棕色;根據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定為Coniella屬.基于ITS的BLAST檢索表明該菌株與Coniella fragariae相似度高達(dá)99.6%以上，鑒定為草莓墊殼孢Coniella fragariae （Oudem.）B.Sutton，該菌屬于半知菌門(mén)，球殼孢目spharropsidales，球殼孢科Sphaeropsidacea墊殼孢屬Coniella，為內(nèi)蒙古新記錄種，以黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen、灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea Pers和茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi et al. 為材料，研究其抑菌活性，發(fā)現(xiàn)Coniella fragariae （Oudem.）B.Sutton對(duì)3種指示菌有不同程度的抑制作用，平均抑菌率分別達(dá)48.2%、43.1%和24.7%，該研究結(jié)果為內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)鑒定提供研究提供方法，并為潛在生防菌的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

關(guān)鍵詞：Coniella屬真菌;培養(yǎng)鑒定;抑菌活性

中圖分類號(hào)：Q914.83 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?文章編號(hào)：1673-260X（2020）06-0033-03

植物內(nèi)生真菌是指在健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙中度過(guò)全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌[1]，主要為子囊菌及其無(wú)性型，少數(shù)擔(dān)子菌和接合菌.內(nèi)生真菌感染植物組織，一般以菌絲存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間，從寄主中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供其生長(zhǎng)所需，同時(shí)內(nèi)生真菌為寄主生長(zhǎng)發(fā)育提供水分、礦物質(zhì)元素等，二者互利互惠[2].植物內(nèi)生真菌普遍存在于植物組織中，種類多，代謝物不僅能刺激植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)寄主的抗逆性，如抗旱、抗寒等能力[3-5]，而且能提高植物對(duì)病蟲(chóng)害的抵抗力[6-10]，研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生具有多種生物活性的新型化合物，如抗生素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、免疫抑制活性物質(zhì)、抗腫瘤活性物質(zhì)等，極有可能成為發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源，在醫(yī)藥、農(nóng)林業(yè)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景.

真菌傳統(tǒng)的分類鑒定主要是根據(jù)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和方式、孢子的形態(tài)學(xué)特征來(lái)確定.但有些內(nèi)生真菌在自然條件和人工培養(yǎng)條件下均以菌絲和無(wú)形態(tài)形式存在，因此給形態(tài)鑒定帶來(lái)困難，ITS即內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是核糖體DNA（rDNA）中的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，該區(qū)域基因在不同菌株間存在豐富的變異，國(guó)內(nèi)外對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行序列分析技術(shù)已很常見(jiàn)，在真菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究報(bào)道很多.本文采用形態(tài)學(xué)鑒定和ITS測(cè)序法對(duì)一株內(nèi)生真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行研究.

1 材料和方法

1.1 供試材料

赤峰學(xué)院校園內(nèi)赤芍（Paeonia lactiflora Pall）為材料，截取健康新鮮的芍藥側(cè)根進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離.

1.2 內(nèi)生菌的分離和純化

取健康芍藥植株側(cè)根用自來(lái)水沖洗干凈晾干，分別用0.1%升汞漂洗10～30s，然后用無(wú)菌水沖洗，再用75%酒精漂洗0.5～1min，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次.樣品經(jīng)處理完畢后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌狀態(tài)下切成0.2cm薄片，切口置于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿3個(gè)樣品.置于28℃條件下黑暗培養(yǎng)3～7d，觀察培養(yǎng)材料切口處長(zhǎng)出菌絲，挑取切口處菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，經(jīng)2～3次純化，得到純培養(yǎng).

1.3 內(nèi)生菌的形態(tài)鑒定

1.3.1 宏觀特征觀察法

根據(jù)內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征，包括菌落正面和背面顏色、紋飾、質(zhì)地以及邊緣形狀、生長(zhǎng)速度、大小進(jìn)行觀察，使用手機(jī)拍照記錄.

1.3.2 顯微觀察

挑取獲得的純培養(yǎng)菌絲，制成徒手切片，鏡檢觀察菌株菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，如：分生孢子梗、分生孢子形態(tài)及大小等.依據(jù)真菌分類文獻(xiàn)進(jìn)行分類鑒定.

1.4 基于rDNA～I(xiàn)TS測(cè)序分子鑒定

將純培養(yǎng)菌絲加入液氮充分碾磨，取真菌組織約30mg，提取基因組DNA，用天根PFU PCR mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物ITS1F/ITS4R，對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化回收（DNA凝膠純化試劑盒，AXYGEN），使用NL4對(duì)回收DNA片段進(jìn)行DNA測(cè)序.

1.5 數(shù)據(jù)處理

用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募?6S數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到比對(duì)結(jié)果，從結(jié)果中挑選出同源性較高的DNA序列，查找相似性最高的菌種，確定分離菌株的分類地位.利用軟件MEGA5.1按照最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)育樹(shù)的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析重復(fù)次數(shù)為1000次.

1.6 該菌株對(duì)幾種植物病原菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)

1.6.1 指示菌

采用植物常見(jiàn)病原菌，黃瓜枯萎病菌黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen 、茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum和灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea Pers菌株均來(lái)自微生物實(shí)驗(yàn)室.

1.6.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用對(duì)峙培養(yǎng)法，在無(wú)菌操作臺(tái)上分別取指示菌定量接種，在固體培養(yǎng)基中，挑取內(nèi)生真菌菌絲或孢子，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù).培養(yǎng)皿置于室溫培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)3天、5天、9天后測(cè)定抑菌圈直徑大小，重復(fù)多次，檢測(cè)其抑菌效果.

1.6.3 抑制效果計(jì)算方法

在無(wú)菌操作臺(tái)上將三種指示菌接種于PDA培養(yǎng)基（d=10cm）中心，周圍接種Gen7，接種3個(gè)接種點(diǎn)，置于室溫24℃，培養(yǎng)72h后開(kāi)始測(cè)量抑菌圈直徑，抑菌率=DCK～DX/DCK×100，DCK=CK菌落直徑，DX=對(duì)峙培養(yǎng)后尖孢鐮刀菌的菌落直徑.

2 結(jié)果與分析

2.1 Gen7菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征

培養(yǎng)特征：菌落起初白色，棉絮狀，背面呈灰白色，后期菌落會(huì)有黑棕色環(huán)形條紋，背面橘黃色，中央色深.最后整個(gè)菌落變?yōu)楹谏?

顯微特征：分生孢子梗未見(jiàn)，產(chǎn)孢細(xì)胞圓柱形，無(wú)色，光滑，直徑6～9μm，分生孢子初期無(wú)色長(zhǎng)橢圓形，單胞頂端鈍圓，無(wú)色，有的有兩油滴，孢子6～8.4μm×4～6μm.

2.1.2 基于rDNA-ITS構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析

以Gen7所測(cè)兩條序列Gen7-1和Gen7-2的ITS基因序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST搜索，表明Gen7-1、7-2與Coniella fragariae（MH861493）相似度100%，Coniella fragariae （MG748688）相似度為99.61%，而與葡萄白腐病菌Coniella diplodiella 90.61%親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與桉樹(shù)小帽殼孢菌Pilidiella eucalyptorum相似度90%，Pilidiella為Coniella同物異名，都屬于半知菌門(mén)，球殼孢目spharropsidales球殼孢科Sphaeropsidaceae.

2.1.3 Gen7鑒定結(jié)果

根據(jù)墊殼孢屬Coniella態(tài)特征的描述[11，12]結(jié)合分子鑒定結(jié)果，該菌為草莓輪紋葉斑病病原草莓墊殼菌Coniella fragariae（Oudem.）B.Sutton.

2.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)Gen7菌株與黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum J.H.Owen、茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Gen5對(duì)所測(cè)試菌均具有不同程度的抑制作用.

從表中可以看出菌株Gen7對(duì)黃瓜尖鐮孢菌平均抑菌率達(dá)48.2%，對(duì)灰葡萄孢菌最大抑菌率達(dá)43.1%，對(duì)茄科勞爾氏菌的平均抑菌率24.7%，培養(yǎng)一周后對(duì)鐮孢菌最大抑菌率70.6%，能明顯抑制黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)，對(duì)灰霉病菌最大抑菌率達(dá)到62.5%，能明顯抑制灰霉病的生長(zhǎng)，而對(duì)茄科病菌抑菌率最大為24.7%，具茄科青枯病菌生長(zhǎng)具有一定的抑制作用.

Gen7對(duì)黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum、茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea在第4天時(shí)，抑菌圈達(dá)到最大分別為48.8mm、20.7mm、40.7mm，抑制作用極強(qiáng)，5天后菌落直徑30mm以上，完全被抑制，生長(zhǎng)緩慢基本停止，7天后抑菌率70%以上，完全被覆蓋.

3 討論

本研究從芍藥根部分離的一株真菌Coniella fragariae，該種存在的變形結(jié)構(gòu)，常被誤定為Pilidiella屬，該種分布廣泛，是植物病原之一，可侵入植物根、莖、葉，寄主范圍較廣，同時(shí)也可腐生于動(dòng)物糞便中，研究表明從鵝肺中分離出的菌株提取的化合物抑制腫瘤細(xì)胞的遷移[13].尖孢鐮刀菌、灰霉病菌和番茄青枯病菌具有很強(qiáng)的抑菌作用，為開(kāi)發(fā)園藝植物病害生防菌提供理論依據(jù)，本研究對(duì)內(nèi)生真菌僅做了分子鑒定及簡(jiǎn)單的抑菌實(shí)驗(yàn)，而內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的功能還需進(jìn)一步研究，為菌物資源的鑒定及安全開(kāi)發(fā)提供依據(jù).

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收稿日期：2020-04-01

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201810138009）

通訊作者：田慧敏（1980～），女，碩士，副教授，主要從事真菌學(xué)多樣性教學(xué)及科研工作，E-mail：tiancfxy2009@126.com