瑞舒伐他汀對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的小鼠血管平滑肌細(xì)胞去分化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響及其機(jī)制研究*

周昌鉆，潘孫雷，林 輝，孟立平，季 政，池菊芳，郭航遠(yuǎn)△

（1.紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 紹興312000；2.溫州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州325000）

高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥是動脈粥樣硬化性冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但是，降Hcy治療能否使患者在心腦血管疾病中獲益在臨床研究中仍未達(dá)成共識［1］。因此，Hcy在心血管疾病中可能具有更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）發(fā)生表型去分化［2］。

血管平滑肌表型的去分化與心腦血管病密切相關(guān)。平滑肌與其他肌細(xì)胞相比，具有很強(qiáng)的表型重塑性。成熟分化的VSMCs呈長梭形，穩(wěn)定表達(dá)包括表型蛋白（smooth muscle actin-α，α-SMA），鈣調(diào)節(jié)蛋白calponin和smoothelin在內(nèi)的收縮相關(guān)蛋白，細(xì)胞增殖與遷移能力極低，稱為收縮型VSMCs。但收縮型VSMCs在異常刺激下可發(fā)生表型去分化，一方面細(xì)胞收縮蛋白表達(dá)減少，分泌蛋白如骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞骨架極性分布減弱；另一方面細(xì)胞增殖、遷移能力增強(qiáng)［3］。VSMCs收縮表型的喪失是冠心病、肺動脈高壓、主動脈瘤等心血管疾病的重要病理變化［3，4］。

現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可能在心血管疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。ERS是細(xì)胞內(nèi)環(huán)境受到干擾后，未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔大量堆積，進(jìn)而影響細(xì)胞功能的異常狀態(tài)。高同型半胱氨酸血癥、高脂血癥、血管機(jī)械損傷等危險(xiǎn)因素都可引起血管壁細(xì)胞ERS狀態(tài)。此外，在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞中也都觀察到ERS發(fā)揮著表型調(diào)控的作用［4］。但是ERS是否參與調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的VSMCs去分化，仍未被人們了解。

臨床中血管保護(hù)藥物，如他汀類藥物被發(fā)現(xiàn)存在藥物作用的多效性［5，6］。但是，這類常用藥物多效性是否與血管ERS狀態(tài)相關(guān)，仍不十分明確。本研究旨在明確瑞舒伐他?。╮osuvastatin，Rsv）對 Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型去分化的影響并探討ERS在其中的作用，進(jìn)一步揭示ERS在他汀類藥物的血管保護(hù)作用的機(jī)制，為血管重構(gòu)性疾病的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級C57BL／6小鼠，雌雄不限，8周左右，體重22～25 g（購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司）。實(shí)驗(yàn)試劑：Hcy、血小板源生長因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）衣霉素、磷脂酸（sigma），Rsy（Medchem Express），4-苯基丁酸（杭州昊鑫生物有限公司），Ⅱ型膠原酶（Vetec），熒光染料 488Ⅰ-鬼筆環(huán)肽（Abnova），real-time PCR試劑盒（Roche），DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO），α-SMA、OPN、calponin、GAPDH單克隆抗體（Abcam），雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、phospho-mTOR（S2448）、P70S6激酶（P70S6 kinase，P70S6K）、phospho-P70S6K（T389）單克隆抗體（Cell Signaling Technology），辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（Abbkine），MTT（Emresco），Transwell小室（Corning）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VSMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)和分組 小鼠VSMCs細(xì)胞用II型膠原酶消化法獲取，傳代3～5代后無血清饑餓培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)1：RSV對 Hcy誘導(dǎo)的VSMCs去分化和ERS狀態(tài)的影響。細(xì)胞分為對照組、Hcy組（1 mmol／L）、PDGF-BB組（30 ng／ml）、Hcy+低 Rsv組（0.1μmol／L）、Hcy+中 Rsv組（1μmol／L）、Hcy+高 Rsv組（10μmol／L），每組設(shè) 3復(fù)孔，分別于培養(yǎng)后 30 min、1 h、2 h、6 h、12 h時(shí)用 realtime-PCR檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、X盒結(jié)合蛋白 1（X-box binding protein 1，XBP1s），同型半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素結(jié)構(gòu)域1（Herpud 1），反映 ERS水平；48 h時(shí)檢測細(xì)胞表型蛋白α-SMA表達(dá)和細(xì)胞骨架變化。實(shí)驗(yàn)2：ERS在Hcy誘導(dǎo)的VSMCs去分化中的作用。細(xì)胞分為對照組、Hcy（1 mmol／L）組、Hcy+Rsv（10μmol／L）組、Hcy+Rsv+衣霉素（tunicamycin，Tm，10μg／ml）組，Hcy+4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate，4-PBA，5 mmol／L）組，每組設(shè)3復(fù)孔，檢測細(xì)胞增殖、遷移和表型蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)3：mTOR信號通路對細(xì)胞ERS影響。細(xì)胞分為對照組、Hcy組、Hcy+Rsv組、Hcy+Rsv+磷脂酸（phosphatidic acid，PA，10μmol／L）組和 Hcy+雷帕霉素（rapamycin，Rapa，50 nmol／L）組，每組設(shè) 3復(fù)孔，干預(yù)30 min后檢測mTOR-P70S6K信號磷酸化程度及ERS水平。

1.2.2 RNA提取檢測 ERS指標(biāo) 經(jīng)典 Trizol-異丙醇沉淀法提取總 RNA，測定濃度純度。Real-time PCR檢測GRP78、XBP1s和Herpud1的mRNA表達(dá)水平?？俁NA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及real-time PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，引物序列如表1所示。記錄Ct值后按2-△△Ct法進(jìn)行相對定量。

Tab.1Primer sequences used for real-time PCR

1.2.3 提取蛋白檢測表型蛋白及信號通路改變

六孔板每孔加入200μl預(yù)冷RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞 30 min，12 000 r／min離心 10 min取上清，加入上清體積1／4體積的5×loading buffer，混勻后沸水浴5 min變性蛋白，置于-80℃環(huán)境凍存。配制SDS PAGE膠，每個(gè)泳道20μg蛋白樣品上樣。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別檢測樣品中α-SMA、OPN、calponin、mTOR、pmTOR、P70S6K、p-P70S6K以及內(nèi)參 GAPDH表達(dá)情況。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別收集3～5代 VSMCs，按上述分組以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基饑餓24 h后更換為每孔100μl條件培養(yǎng)基，分別培養(yǎng) 12 h、24 h、36 h、48 h后，按每孔加入 20μl MTT液（5 mg／ml）。避光孵育 4 h，小心棄上清，每孔加入200μl DMSO，震蕩溶解結(jié)晶后，測量各孔579 nm波長下吸光值，獨(dú)立使用重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取 3～5代 VSMCs，培養(yǎng)基中加入羥基脲（1.8 mmol／L）抑制增殖，12 h后重懸浮 VSMCs（3×104cells／ml）。在 Transwell小室上腔室（0.8μm）中加入 200μl細(xì)胞懸液，下室加入完全培養(yǎng)基。2 h后待細(xì)胞貼壁，上室更換為無血清的條件培養(yǎng)基。24 h后多聚甲醛固定，棉簽拭去上層細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，于倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)各視野細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 細(xì)胞骨架鬼筆環(huán)肽染色 取無菌蓋玻片置于6孔板中，按每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后無血清饑餓24 h，無血清條件培養(yǎng)基干預(yù)48 h后，多聚甲醛固定，鬼筆環(huán)肽染液避光孵育2 h，PBS洗滌3次后，在熒光顯微鏡490 nm激發(fā)波長觀察細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)間兩兩比較用 Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，并用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 瑞舒伐他汀對VSMCs微絲骨架分布影響

對照組細(xì)胞微絲骨架極性明顯，細(xì)胞呈長條形或長梭形；Hcy組及PDGF-BB組細(xì)胞呈短梭形或橢圓形，微絲分布紊亂；添加瑞舒伐他汀可增強(qiáng)細(xì)胞微絲骨架分布的極性，恢復(fù)細(xì)胞長梭形外形，該作用隨他汀濃度增加而增強(qiáng)（圖1）。

Fig.1 Effects of rosuvastatin on location and changes inform of actin cytoskeleton were detected with phalloidin（×400）

2.2 瑞舒伐他汀對Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型去分化的影響

Western實(shí)驗(yàn)顯示，Hcy組較對照組，α-SMA、calponin表達(dá)下調(diào)，OPN表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；添加瑞舒伐他汀可增強(qiáng)Hcy組α-SMA、calponin表達(dá)，抑制OPN表達(dá)，且作用隨他汀濃度的提高而增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01，圖 2）。結(jié)果顯示 RSV干預(yù)可抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs去分化，維持細(xì)胞收縮表型。

Fig.2 Effects of Hcy and rosuvastatin on VSMCs phenotype markers expression（n＝3）

2.3 瑞舒伐他汀對Hcy誘導(dǎo)的ERS的影響

藥物干預(yù) 30 min時(shí)，與對照組相比 Hcy組GRP78、Herpud1和XBP1s mRNA水平升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10μmol／L Rsv+Hcy組較 Hcy組 GRP78和 XBP1s mRNA水平降低（1.400±0.236 vs 2.562±0.340，1.045±0.137 vs 5.923±0.939，P＜0.05），Herpud1 mRNA水平降低（1.385±0.101 vs 5.923±0.755，P＜0.01），且 Rsv對 ERS的抑制作用隨濃度升高和時(shí)間延長而增強(qiáng)（圖3）。

Fig.3 Effects of rosuvastatin on Hcy mediated（±s，n＝3）

2.4 ERS對VSMCs表型去分化的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)中，Hcy組較對照組穿透纖維膜的遷移細(xì)胞數(shù)量明顯增加；Hcy+Rsv組和Hcy+4-PBA組較Hcy組，細(xì)胞遷移數(shù)量減少（分別為56.7±9.4 vs 72.4±16.8，48.3±6.5 vs 72.4±16.8）；Hcy+Rsv+Tm組細(xì)胞遷移數(shù)高于Hcy+Rsv組（96.1±18.3 vs 56.7±9.4，圖 4A）。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Hcy+Rsv組和Hcy+4-PBA組細(xì)胞活性低于Hcy組，Hcy+Rsv+Tm組細(xì)胞活性高于 Hcy+Rsv組（圖4B）。Western blot發(fā)現(xiàn)4-PBA可抑制 Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型蛋白去分化改變，而Hcy+Rsv+Tm組較Hcy+Rsv組表型蛋白去分化程度高（圖4C、D）。

2.5 mTOR信號通路對ERS的調(diào)節(jié)作用

Hcy組較對照組mTOR、P70S6K磷酸水平明顯增強(qiáng)；Hcy+Rsv組和Hcy+Rapa組mTOR和P70S6K磷酸化較Hcy組受到抑制（圖5A、B），且ERS水平減輕（圖5C）；Hcy+Rsv+PA組較 Hcy+Rsv組 mTORP70S6K磷酸化信號增強(qiáng)，ERS水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

VSMCs細(xì)胞表型的去分化發(fā)生在動脈粥樣硬化、高血壓、主動脈瘤等心血管疾病的病理生理過程中。VSMCs的去分化并沒有特異性的指標(biāo)，因此對VSMCs去分化的鑒定常需從細(xì)胞形態(tài)觀察、表型蛋白表達(dá)以及細(xì)胞增殖、遷移能力等多個(gè)方面的共同確認(rèn)。盡管，VSMCs可向多種細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，比如巨噬細(xì)胞樣表型、軟骨細(xì)胞樣表型、泡沫細(xì)胞表型等，但 VMSCs的去分化是其中的共同過程［7，8］。

Fig.4 Role of ERSin VSMCs phenotype switch（±s，n＝3）

Fig.5 mTOR-P70S6K signaling in ERSmodulation（n＝3）

高Hcy血癥是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可誘導(dǎo)血管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡或死亡。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，Hcy在引起血管壁細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)凋亡的同時(shí)，也會誘導(dǎo)細(xì)胞ERS的發(fā)生和VSMCs收縮表型的喪失［2，9］。但 ERS在其誘導(dǎo) VSMCs去分化中的作用，還未被人們完全了解。Hcy介導(dǎo) mTORP70S6K信號激活，可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中“流入”的新生多肽急劇增加，加重了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多肽折疊功能負(fù)荷，進(jìn)一步造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)環(huán)境紊亂。此外，高濃度Hcy還會引起基因組廣泛的甲基化，這也可能是導(dǎo)致細(xì)胞蛋白代謝紊亂的重要機(jī)制［10］。

ERS在哺乳動物的胚胎發(fā)育和生長中扮演著重要的角色。通過人工藥物干預(yù)減輕胚胎的ERS水平，可導(dǎo)致胚胎的發(fā)育成熟速度加快；反之，在哺乳動物孕期給予ERS誘導(dǎo)劑刺激，則會引起胚胎發(fā)育遲滯，早產(chǎn)甚至流產(chǎn)［11，12］。此外，糖尿病相關(guān)研究中觀察到，ERS下游信號的紊亂可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的胰島素釋放功能受損［13］。以上證據(jù)都提示ERS及其下游信號在組織發(fā)育及功能維持中的關(guān)鍵作用。

研究學(xué)者在動脈粥樣硬化、高血壓、主動脈瘤及心肌病中均觀察到血管或心肌的異常ERS狀態(tài)［14］。ERS除了能引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致組織中細(xì)胞喪失外，細(xì)胞功能表型的改變也可能是其在心血管疾病中的另一項(xiàng)重要致病機(jī)制。研究者通過tunicamycin等ERS誘導(dǎo)藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)動物后，發(fā)現(xiàn)血管的ERS可能引起血管順應(yīng)性降低，整體血壓升高以及內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等血管異常狀態(tài)［15］。Carlisle等在動物實(shí)驗(yàn)中觀察到，4-PBA干預(yù)可顯著減輕血管的病理性肥厚［16］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型的去分化作用以及瑞舒伐他汀的表型保護(hù)作用可能與細(xì)胞ERS相關(guān)。瑞舒伐他汀濃度依賴性的抑制 Hcy誘導(dǎo)的 ERS。進(jìn)而用 ERS誘導(dǎo)劑 tunicamycin增強(qiáng)ERS水平后，Rsv的表型保護(hù)作用被顯著抑制；反之，同時(shí)用Hcy和4-PBA干預(yù)細(xì)胞，VSMCs仍能維持較強(qiáng)的收縮表型，提示VSMCs收縮表型受到ERS水平調(diào)控。

ERS對VSMCs細(xì)胞表型的調(diào)控可能與ERS下游的激活信號相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，XBP1s可與細(xì)胞表型的重要調(diào)控因子Kruppel like factor 4和間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子Snail1的基因啟動子結(jié)合，影響相關(guān)因子的表達(dá)［17，18］。Shinozaki S團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，敲除 ERS激活的下游蛋白Herpud1能顯著減輕高脂小鼠動脈斑塊的面積，增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性［19］。以上研究都提示ERS下游信號在血管壁細(xì)胞表型調(diào)控中的潛在作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，常用的血管保護(hù)藥物-他汀類藥物，有一部分非降脂依賴的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控血管壁細(xì)胞的ERS狀態(tài)，維持VSMCs收縮表型實(shí)現(xiàn)的。

本研究提示，瑞舒伐他汀可能通過抑制mTORP70S6K信號通路磷酸化，減輕細(xì)胞ERS狀態(tài)，進(jìn)而抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs表型去分化。通過抑制血管組織的ERS狀態(tài)或阻斷ERS下游的特異性信號通路，保護(hù)細(xì)胞功能表型，可能是對動脈粥樣硬化、高Hcy型高血壓等發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的血管重構(gòu)疾病的潛在治療策略。

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