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    不同強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練對心肌凋亡途徑微小RNA及其靶蛋白的影響*

    2018-05-15 03:51:47趙永才付近梅高炳宏
    關(guān)鍵詞:心肌細(xì)胞顯著性調(diào)節(jié)

    趙永才,付近梅,高炳宏△

    (1.上海體育學(xué)院,上海200438;2.江西省體育科學(xué)研究所,南昌330006)

    凋亡是細(xì)胞發(fā)生的一種程序性死亡,由基因控制的細(xì)胞主動性死亡過程。凋亡在生長發(fā)育、預(yù)防有絲分裂組織癌變等生理過程中起積極作用,但過高水平凋亡卻與心肌組織功能紊亂、心血管疾病發(fā)病密切相關(guān)。心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞,其凋亡的發(fā)生對心肌生理機(jī)能影響較大,雖然心肌細(xì)胞也存在微弱增殖能力,但效率過低,不足以彌補(bǔ)一些病理應(yīng)激所引發(fā)的細(xì)胞流失[1]。因此尋求干預(yù)手段來減少、延緩心肌細(xì)胞凋亡成為研究熱點。

    線粒體調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡信號,各類應(yīng)激可引發(fā)線粒體膜電位發(fā)生變化,改變線粒體膜Bcl-2的表達(dá)和定位,影響細(xì)胞色素 c釋放和 caspase蛋白激活[2];外源性凋亡途徑中,Programmed cell death 4(PDCD4)分子在促凋亡發(fā)生中起關(guān)鍵作用。微小RNA(microRNAs,miRs)在心肌細(xì)胞內(nèi)、外源凋亡途徑中發(fā)揮作用,miR-1在心肌中特異性高表達(dá),直接以Bcl-2 mRNA為靶目標(biāo),抑制其蛋白表達(dá),一定程度發(fā)揮促凋亡的作用[3]。而 miR-21以 PDCD4 mRNA為靶目標(biāo),抑制其蛋白表達(dá),發(fā)揮抗凋亡作用[4]。研究認(rèn)為適當(dāng)運(yùn)動能夠降低人群心血管應(yīng)激所引發(fā)的死亡率[5]。動物研究也表明運(yùn)動可減少高血壓心肌細(xì)胞內(nèi)外源凋亡信號強(qiáng)度[6]。運(yùn)動訓(xùn)練干預(yù)心肌凋亡的過程中,相關(guān)miRs以及下游靶蛋白有何變化,目前報道較少。本文考察游泳訓(xùn)練對心肌miR-1、miR-21以及 Bcl-2、PDCD4、Bax蛋白的影響,討論運(yùn)動干預(yù)心肌凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及分組

    21只雄性 2月齡 C57BL/6小鼠,平均體重為(17±1.8)g,分籠飼養(yǎng)。普通動物飼料自由取食、飲水。采用人工照明模擬晝夜節(jié)律,隨機(jī)分3組(n=7):安靜組(sedentary group,SE)、訓(xùn)練組 1(exercise training group 1,ET1),訓(xùn)練組 2(exercise training group 2,ET2)。

    1.2 游泳運(yùn)動安排及取材

    小鼠先進(jìn)行1周適應(yīng)性游泳。實驗正式開始,SE組不做運(yùn)動干預(yù);ET1組進(jìn)行8周游泳運(yùn)動訓(xùn)練,每周前5 d運(yùn)動,每天1次,第1周30 min/count,以后每周每次再增加10 min,最后兩周訓(xùn)練時間維持在90 min;ET2組前5周運(yùn)動方案與ET1相同,后3周每天訓(xùn)練2次(早、晚各1次),每次訓(xùn)練時間和ET1相同。訓(xùn)練結(jié)束后,取小鼠心肌組織,一部分用于制作TUNEL檢測切片,另一部分-80℃冷凍備用。

    1.3 TUNEL凋亡檢測方法

    使用 TUNEL檢測試劑盒(Promega公司)進(jìn)行TUNEL凋亡檢測:使用二甲苯2次脫蠟,梯度濃度酒精脫水,多聚甲醛固定;20μg/ml蛋白酶 k室溫孵育,多聚甲醛固定;Equilibration Buffer室溫平衡10 min,rTdT反應(yīng)液 37℃孵育 60 min;3%H2O2室溫封閉 10 min,加 Streptavidin HRP(1∶500 PBS稀釋);顯色后封片。隨機(jī)視野下計數(shù)總細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,獲取凋亡指數(shù)。

    1.4 miRs檢測

    1.4.1 引物設(shè)計及miRs逆轉(zhuǎn)錄 Invitrogen公司提供RNA提取試劑盒,嚴(yán)格操作抽提總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,符合實驗要求,然后采用miRs-Stem-Loop反轉(zhuǎn)錄引物合成 cDNA。Primer 5.0引物軟件設(shè)計所需引物,依據(jù)檢測目標(biāo)(miR-1、miR-21和U6內(nèi)參)的序列設(shè)計擴(kuò)增引物(表1)。

    1.4.2 RT-PCR反應(yīng) 擴(kuò)增反應(yīng)包括如下各類試劑:提取的 cDNA 1μl,miRs上游引物 0.5μl,通用型miRs下游引物 0.5μl,Power SYBR Green PCR Master Mix 10μl(SYBR Green、DNA聚合酶、dNTP、Buffer),無核酸酶水8μl。完成共計40個反應(yīng)循環(huán),擴(kuò)增溫度如下:95℃變性 10 min;95℃15 s;60℃1 min。應(yīng)用ABI 7900 PCR儀,指標(biāo)有:熔解曲線、CT值及△CT值。miRs相對含量用 2-ΔΔCT公式計算。

    Tab.1Primers of miR-1 and miR-21

    1.5 Western blot檢測蛋白的表達(dá)

    利用Western blot技術(shù)檢測目的蛋白相對表達(dá)量,先提取總蛋白,蛋白上樣后電泳,使用PVDF膜將蛋白轉(zhuǎn)印,4℃孵育過夜,Bcl-2、Bax和PDCD4一抗(Santa Cruz提供)稀釋濃度均為 1∶1 000,GAPDH抗體稀釋濃度為1∶10 000。凝膠成像系統(tǒng)獲得目的蛋白灰度。經(jīng)過數(shù)值轉(zhuǎn)化,SE組均值為1,對比觀察其它組表達(dá)。

    1.6 統(tǒng)計分析

    使用 PASW Statistics 18.0統(tǒng)計軟件,One-way ANOVA統(tǒng)計方法分析數(shù)據(jù),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果

    2.1 運(yùn)動訓(xùn)練對心肌凋亡的影響

    相比 SE組凋亡指數(shù)(2.26±0.55)%,ET1組凋亡指數(shù) (2.41±0.56)%無顯著變化,ET2組凋亡指數(shù)(1.45±0.39)%顯著性下降(P<0.01);ET2組凋亡指數(shù)也顯著低于 ET1組(P<0.01)。

    2.2 運(yùn)動訓(xùn)練后心肌miR-1、miR-21表達(dá)結(jié)果

    相比SE組、ET1組miR-1的下降趨勢不明顯,但 ET2組miR-1降低幅度達(dá)29%(P<0.01);ET1組miR-21表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢,ET2組miR-21表達(dá)升高幅度大,具有顯著性差異(P<0.05,表 2)。

    2.3 運(yùn)動訓(xùn)練后心肌Bcl-2、PDCD4和Bax蛋白表達(dá)的變化

    MiRs可抑制靶蛋白表達(dá),通過免疫印跡法分別測定miR-1、miR-21的靶蛋白 Bcl-2和 PDCD4,另外Bax蛋白在線粒體途徑凋亡信號中起促凋亡作用,一并檢測。運(yùn)動訓(xùn)練促進(jìn)Bcl-2表達(dá),ET1組和ET2組表達(dá)均顯著性高于SE組,提高幅度分別達(dá)86%和98%(P<0.01);PDCD4蛋白表達(dá)未呈現(xiàn)顯著性變化,相比SE組,ET1組和ET2組表達(dá)僅有降低趨勢,無統(tǒng)計意義;Bax蛋白變化與Bcl-2相反,相比SE組,ET1組和ET2組表達(dá)均顯著性降低,降幅分別達(dá)38%和 60% (P<0.01,圖1)。

    Tab.2 Expressions of myocardial miR-1 and miR-21 after training(±s,n=7)

    Tab.2 Expressions of myocardial miR-1 and miR-21 after training(±s,n=7)

    SE:Sedentary group;ET1:Exercise group 1;ET2:Exercise group 2*P<0.05,**P<0.01 vs SE group

    Group miR-1 miR-21 SE 1.47±0.22 1.22±0.10 ET1 1.38±0.15 1.27±0.24 ET2 1.05±0.19** 1.43±0.23*

    Fig.1 Effects of exercise training on Bcl-2、PDCD4 and Bax levels

    2.4 miRs和靶蛋白相關(guān)性及訓(xùn)練后Bcl-2/Bax的變化

    對本次研究篩選的miRs和靶蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。在不同負(fù)荷狀態(tài)下,miR-1和Bcl-2呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05);而本次研究miR-21和 PDCD4并沒有呈現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)。另外對Bcl-2和Bax相對表達(dá)比值進(jìn)行計算,Bcl-2和Bax分別代表內(nèi)源性凋亡途徑抗凋亡和促凋亡的信號蛋白,研究發(fā)現(xiàn) ET1組 Bcl-2/Bax比值增加 2倍,ET2組增加接近4倍,都具有顯著性差異(P<0.01,圖2)。

    3 討論

    Fig.2 Correlation between miRs and miR-targeted protein and the Bcl-2/Bax ratio

    心臟在經(jīng)歷各類不良應(yīng)激時凋亡水平會增加,例如缺血/再灌注、心衰以及衰老,另一方面,各種原因引發(fā)的過高水平心肌凋亡又加劇心臟機(jī)能的衰退,是各類心臟病發(fā)病的病理基礎(chǔ)[7]。因此尋求各類干預(yù)心肌凋亡的手段,提高心肌的抗凋亡能力、減少心肌細(xì)胞凋亡流失是目前應(yīng)用基礎(chǔ)研究的熱點。目前認(rèn)為運(yùn)動具有心肌保護(hù)效應(yīng),尤其降低病理狀態(tài)下凋亡效應(yīng)更佳。例如高血壓大鼠心肌凋亡水平相對較高,而運(yùn)動訓(xùn)練能夠降低高血壓大鼠心肌凋亡指數(shù),減少內(nèi)外源途徑促凋亡蛋白的表達(dá)[6]。高脂飲食可建立大鼠肥胖模型,肥胖大鼠血脂紊亂,心肌細(xì)胞凋亡水平升高,6周游泳訓(xùn)練能夠降低肥胖大鼠心肌凋亡水平,認(rèn)為與心肌抗氧化酶增加、一氧化氮合酶減少有關(guān)[8]。生理狀態(tài)下運(yùn)動訓(xùn)練是否能干預(yù)心肌凋亡,也有研究進(jìn)行考察,但結(jié)論有異同。Siu等人[9]早期對成年健康大鼠進(jìn)行8周跑臺耐力訓(xùn)練,發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練組大鼠心肌Bcl-2、HSP70和Mn-SOD顯著提高,認(rèn)為跑臺訓(xùn)練可提高生理水平心肌細(xì)胞抗凋亡基因表達(dá),減少心肌凋亡流失。而來自Kwak等人[10]的研究認(rèn)為游泳訓(xùn)練可明顯降低衰老大鼠心肌凋亡水平,但對成年大鼠心肌凋亡影響不明顯。目前認(rèn)為運(yùn)動保護(hù)心肌效應(yīng)主要與心肌線粒體適應(yīng)有關(guān),運(yùn)動可增加線粒體抗氧化物質(zhì)儲備,在氧化應(yīng)激下可減少線粒體細(xì)胞色素C釋放,減少心肌凋亡水平[5]。本實驗表明生理狀態(tài)下,本次ET2組中等強(qiáng)度負(fù)荷訓(xùn)練有效延緩小鼠心肌凋亡,對心肌具有一定保護(hù)效應(yīng)。

    miRs屬于約22nt長非編碼RNA,可與靶蛋白mRNA結(jié)合,抑制蛋白翻譯表達(dá)或者降解 mRNA,miRs參與到心臟功能的調(diào)節(jié),包括心肌生長、電傳導(dǎo)、心肌收縮和凋亡等過程[11],其中 miR-1和 miR-21明顯調(diào)節(jié)心肌凋亡。研究[3]認(rèn)為miR-1特異性在心肌中高表達(dá),可以通過抑制下游靶蛋白調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡,miR-1直接以Bcl-2為靶目標(biāo),抑制Bcl-2 mRNA翻譯表達(dá)控制心肌凋亡水平。本次研究發(fā)現(xiàn)ET2組運(yùn)動訓(xùn)練顯著降低心肌miR-1表達(dá),但ET1組miR-1表達(dá)降低無統(tǒng)計意義。與miR-1變化相反,兩個訓(xùn)練組Bcl-2表達(dá)均顯著性提高,表明miR-1下降可能有利于Bcl-2生成表達(dá),這種效應(yīng)在ET2組體現(xiàn)更明顯。對miR-1和Bcl-2進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著性負(fù)相關(guān)。以上表明miR-1和Bcl-2變化對運(yùn)動訓(xùn)練的適應(yīng)性變化可能是運(yùn)動訓(xùn)練減緩心肌凋亡的機(jī)制之一,尤其ET2組中等負(fù)荷強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練可能通過miR-1和Bcl-2的變化延緩心肌凋亡。相對而言,ET1組小強(qiáng)度耐力訓(xùn)練對miR-1和Bcl-2影響相對較小。

    MiR-21在心肌中表達(dá)比較豐富,目前發(fā)現(xiàn)其在凋亡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,心梗模型過表達(dá)miR-21能夠明顯降低細(xì)胞凋亡水平,并減少心梗區(qū)域面積并改善左心室重塑水平[12]。另一項研究[4]證實 miR-21能夠直接結(jié)合PDCD4 mRNA,靶向抑制其表達(dá),對抗凋亡。本次研究發(fā)現(xiàn)ET1組miR-21無明顯變化,ET2組miR-21表達(dá)顯著提高,而ET1、ET2組PDCD4蛋白表達(dá)均無顯著性變化,僅有下降趨勢,表明PDCD4蛋白對本次研究兩種運(yùn)動負(fù)荷不敏感。另外也并未發(fā)現(xiàn)miR-21和PDCD4有顯著負(fù)相關(guān)。有其它研究[13]發(fā)現(xiàn)miR-21和PDCD4在不同心肌缺血預(yù)適應(yīng)模型中變化缺乏規(guī)律,無相關(guān)性,說明miR-21和PDCD4調(diào)節(jié)比較復(fù)雜,體內(nèi)實驗中PDCD4可能受更多其它因素調(diào)節(jié),訓(xùn)練對其干預(yù)不明顯??傮w上盡管ET2組訓(xùn)練負(fù)荷提高miR-21表達(dá),但PDCD4對訓(xùn)練不敏感,miR-21和PDCD4變化特點與ET2組凋亡指數(shù)下降不吻合,可能不參與運(yùn)動干預(yù)心肌凋亡的分子調(diào)節(jié)中。本研究認(rèn)為miR-1及靶蛋白Bcl-2對訓(xùn)練的適應(yīng)變化可能參與到運(yùn)動保護(hù)心肌效應(yīng)的分子調(diào)節(jié)通路,但miR-21和靶蛋白PDCD4變化并不參與此調(diào)節(jié)通路。值得關(guān)注的是基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)miR-21具有心肌保護(hù)效應(yīng),而且其靶蛋白眾多,還包括FasL、PTEN等[14],miR-21是否通過抑制其它靶蛋白參與運(yùn)動保護(hù)心肌效應(yīng)還有待考察。

    本次研究對Bax也進(jìn)行測定,對比Bcl-2/Bax比值對運(yùn)動訓(xùn)練的適應(yīng)情況,在內(nèi)源性凋亡途徑中,Bcl-2起抗凋亡的作用,而Bax代表促凋亡的因子,兩者比值變化一定程度上反映凋亡信號的轉(zhuǎn)變。本次研究發(fā)現(xiàn)兩種訓(xùn)練負(fù)荷均顯著提升Bcl-2/Bax比值,表明兩種訓(xùn)練負(fù)荷均能提高抗凋亡的信號強(qiáng)度,結(jié)合兩個訓(xùn)練組凋亡指數(shù),相對而言,只有ET2組中等負(fù)荷強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練能夠顯著降低心肌凋亡水平。

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