氫氣對慢性間歇性低氧大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷的改善作用*

楊勝昌，陳玲玲，傅 天，李文雅，吉恩生△

（1.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊050200；2.河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊050017）

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）以間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）為典型的病理生理特征，其缺氧／復(fù)氧的過程類似于缺血／再灌注損傷，可通過氧化應(yīng)激引起多器官損傷，也是引起代謝綜合征和胰島素抵抗的獨(dú)立危險因素［1］。研究顯示，伴隨OSAS的非酒精性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者，CIH可促進(jìn)其病程發(fā)展，從非酒精性脂肪肝進(jìn)展為肝脂肪變性、肝硬化甚至肝癌。未伴隨NAFLD大鼠，CIH也可獨(dú)立驅(qū)動肝脂質(zhì)過氧化過程，促進(jìn)炎癥反應(yīng)調(diào)控因子活性，進(jìn)而造成輕度肝損傷［2］。目前OSAS常用的治療方法包括持續(xù)正壓通氣治療、口腔矯治器治療及手術(shù)治療，但這些方法副作用大或患者依從性差。氫氣為一種小分子還原性氣體，具有抗氧化作用，吸入氫氣或者靜脈注射含有氫氣的生理鹽水具有減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的作用，從而對缺血／再灌注損傷臟器有明顯的改善作用［3］。本研究通過建立慢性間歇性低氧模型，模擬臨床睡眠呼吸暫停的周期性低氧狀態(tài)，探究吸入氫氣對間歇性低氧引起肝臟損傷中炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，為OSAS治療尋求新的方法途徑提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年雄性SD大鼠，體重180～200 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，大鼠被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的鼠籠中，每天接受 12 h的光照，自由進(jìn)水進(jìn)食。24只雄性 SD大鼠隨機(jī)分為3組（n＝8）：常氧組（normoxia，Norm組）、間歇性低氧組（CIH組）、氫氣（hydrogen，H2）+間歇性低氧組（H2+CIH組）。CIH組大鼠放置于間歇性低氧裝置內(nèi)，前 1.5 min向艙內(nèi)充入氮?dú)馐寡鯘舛冉档偷?%，后1.5 min向艙內(nèi)充入氧氣，使氧氣濃度逐漸上升至21%。間歇性低氧暴露時間為每個循環(huán) 3 min，每天暴露 8 h，共 35 d；H2+CIH組大鼠在每天8 h間歇性低氧暴露前接受1 h濃度為67%H2吸入處理，共35 d；常氧組大鼠置于艙內(nèi)，充入空氣。

1.2 主要試劑與儀器

8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所）；白介素-1（interleukin-1，IL-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，AST）；高 密 度 脂 蛋 白 （high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）（長春匯力生物技術(shù)有限公司）；甘油三酯（triacylglyceride，TG）、血清總膽固醇 （serum total cholesterol，TC）（中生北控生物科技股份有限公司）；動物間歇性低氧裝置（Oxycycler Model A84BioSpherix）；惠美氫氧霧化機(jī)及動物吸氫裝置（上?；菝泪t(yī)療科技有限公司，AMS-H-01型）；H-7650透射電鏡（日本日立公司）；半自動生化分析儀（德國豪邁 Humalyzer2000）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肝臟超微結(jié)構(gòu)的觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠麻醉狀態(tài)下開腹，暴露肝臟，取部分肝臟組織置于2.5%戊二醛，1%四氧化鋨固定，各級無水乙醇脫水，環(huán)氧丙烷過渡，包埋，肝組織超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色。透射電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.2 血清指標(biāo)的檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠，經(jīng)下腔靜脈插管取血，離心提取血清，血清中的8-OHdG采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，IL-1、IL-6采用放免法檢測測定，SOD、TC、TG、LDL、HDL、ALT和 AST水平采用化學(xué)法測定，具體操作按照試劑盒詳細(xì)說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組均值的比較行單因素方差分析，用最小顯著差異法（LSD）作兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 氫氣致慢性間歇性低氧大鼠肝臟功能損傷的改變

電鏡下觀察到：Norm組肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，線粒體嵴整齊排列，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常；CIH組肝臟組織細(xì)胞呈現(xiàn)明顯空泡化，線粒體嵴融合，部分線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失，呈現(xiàn)空泡化；H2+CIH組肝臟組織細(xì)胞內(nèi)空泡明顯減少，線粒體輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張（圖1）。

肝臟生化血清學(xué)指標(biāo)顯示間歇性低氧組ALT，AST水平顯著高于常氧組（P＜0.05）；氫氣干預(yù)后血清中ALT，AST水平明顯降低，與CIH組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表 1）。

Tab.1 Serum level of ALT，AST（U／L，±s，n＝8）

Tab.1 Serum level of ALT，AST（U／L，±s，n＝8）

CIH：Chronic intermittent hypoxia；ALT：Glutamic-pyruvic transaminase；AST：Glutamic-oxalacetic transaminase*P＜0.05 vs Norm group；#P＜0.05 vs CIH group

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2.2 氫氣對慢性間歇性低氧大鼠肝臟脂代謝的作用

間歇性低氧組的TC、TG、LDL水平高于常氧組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。氫氣干預(yù)后的TC、TG、LDL水平較間歇性低氧組降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組HDL水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（表2）。

Fig.1 Effect of hydrogen on liver injury in CIH rats

間歇性低氧組大鼠的血清IL-6水平顯著高于常氧組（P＜0.05），氫氣干預(yù)后的血清IL-6水平明顯低于間歇性低氧組（P＜0.05）；而血清 IL-1水平在各組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

Tab.2 Serum level of TC，TG，LDL，HDL（mmol／L，±s，n＝8）

Tab.2 Serum level of TC，TG，LDL，HDL（mmol／L，±s，n＝8）

TC：Serum total cholesterol；TG：Triacylglyceride；LDL：Low density lipoprotein；HDL：High density lipoprotein

Group TC TG LDL HDL Norm 1.28±0.22 0.35±0.21 0.98±0.55 0.24±0.21 CIH 1.44±0.31 0.45±0.23 1.07±0.20 0.25±0.43 CIH+H21.42±0.27 0.38±0.10 1.08±0.13 0.26±0.13

Tab.3 Serum level of IL-1，IL-6（pg／ml，±s，n＝8）

Tab.3 Serum level of IL-1，IL-6（pg／ml，±s，n＝8）

IL：Interleukin*P＜0.05 vs Norm group；#P＜0.05 vs CIH group

Group IL-1 IL-6 Norm 89.62±25.58 63.15±6.88 CIH 127.56±23.47 138.12±19.43*H2+CIH 105.23±10.92 89.20±9.05#

2.3 氫氣對慢性間歇性低氧大鼠氧化應(yīng)激的影響

間歇性低氧處理后，8-OHdG水平明顯升高，SOD明顯低于常氧組；氫氣干預(yù)后，8-OhdG水平顯著下降，SOD明顯升高，與間歇性低氧組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表 4）。

Tab.4 Serum level of 8-OHdGand SOD（±s，n＝8）

Tab.4 Serum level of 8-OHdGand SOD（±s，n＝8）

8-OHdG：8-hydroxy-2 deoxygua-nosine；SOD：Superoxide dismutase*P＜0.05 vs Norm group；#P＜0.05 vs CIH group

Group 8-OHdG（ng／ml） SOD（U／ml ）Norm 11.71±0.40 193.05±10.07 CIH 12.38±0.62* 225.52±16.04*H2+CIH 11.90±0.31# 280.26±28.51#

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS）以間歇性低氧（CIH）為典型病理生理特征，是一種潛在的危險性疾病，OSAS可作為獨(dú)立的危險因素影響糖尿病，代謝綜合征和心血管疾病。流行病調(diào)查顯示超過4%普通人群及35%～45%的肥胖個體患有OSAS［1，2］。慢性間歇性低氧（CIH）即重復(fù)性的缺氧 ／復(fù)氧類似于缺血／再灌注損傷可引起多器官損傷，在CIH過程中，反復(fù)發(fā)作的低氧可升高氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物水平，氧化應(yīng)激與炎癥之間存在復(fù)雜關(guān)系，其以不同方式促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，而隨后的炎癥狀態(tài)和再灌注損傷因子又可導(dǎo)致氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物進(jìn)一步增加。此過程中還常引發(fā)內(nèi)皮功能障礙、代謝紊亂和胰島素抵抗［3，4］。OSAS對肝臟的損傷主要表現(xiàn)為肝臟可出現(xiàn)損傷、炎癥、纖維化等病理改變。

氫氣是一種具有生理活性的還原氣體，具有選擇性抗氧化作用，在非高壓狀態(tài)下可改善大鼠的腦缺血再灌注損傷，也可降低心肌缺血／再灌注損傷，其易透過細(xì)胞膜，即使高濃度氫氣也已通過在人類的安全性證明，不具有細(xì)胞毒性作用［5］。

本研究結(jié)果顯示，慢性間歇性低氧模型大鼠肝臟組織超微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高。另外，以往研究提示間歇性缺氧可誘導(dǎo)脂代謝紊亂而導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生，而且脂代謝異常與低氧嚴(yán)重程度密切相關(guān)［6，7］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)間歇性低氧模型對成年健康大鼠血脂代謝并無顯著影響，大鼠血中TC、TG、LDL僅輕度升高并無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示我們所采用模型的低氧程度不足以導(dǎo)致大鼠血脂代謝明顯異常。高濃度氫氣干預(yù)可明顯減輕肝臟的損傷和轉(zhuǎn)氨酶升高，提示氫氣可以改善間歇性低氧所致肝臟功能的損害，其可能的機(jī)制涉及氧化應(yīng)激和炎癥損傷。

8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）作為 DNA氧化損傷指標(biāo)可反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平。OSAS患者尿中8-OHdG水平與OSAS嚴(yán)重程度之間存在相關(guān)性，8-OHdG與OSAS患者睡眠呼吸監(jiān)測指標(biāo)如睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)、血氧飽和度下降指數(shù)、血氧飽和度小于90%時間、呼吸覺醒指數(shù)之間均存在水平相關(guān)［8-10］。SOD可催化分解超氧化物自由基減輕其對細(xì)胞失衡后的SOD水平降低［11］，而氫氣可以降低血清8-OHdG含量，維持SOD水平。氫氣作為一種具有生物活性的分子易透過細(xì)胞膜介導(dǎo)信號通路可減輕間歇性低氧大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的損傷，提示氫氣可以清除體內(nèi)的氧自由基，維持正常線粒體活性，從而起到肝臟保護(hù)作用。

OSAS患者血清中IL-6水平及IL-6 mRNA的表達(dá)與夜間低氧的水平呈正相關(guān)［12］。促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α還參與下丘腦、海馬等睡眠相關(guān)腦區(qū)功能調(diào)節(jié)［13］。本研究顯示，間歇性低氧能導(dǎo)致血IL-6水平均顯著升高，但是血脂水平并無明顯變化，提示CIH啟動促炎性反應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路與代謝性炎癥無關(guān)。氫氣治療組IL-6水平降低，提示氫氣可能由于減輕氧化應(yīng)激而間接引起炎癥減輕。本實(shí)驗(yàn)中該研究未能證實(shí)氫氣是否直接具有直接抗炎作用而減輕OSAS的炎癥損傷。

綜上所述，本研究顯示間歇性低氧可導(dǎo)致全身氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟功能受損。氫氣干預(yù)可以明顯改善間歇性低氧環(huán)境對大鼠肝臟造成的損傷，主要通過減輕氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮改善肝細(xì)胞損傷的作用。關(guān)于氫氣治療間歇性低氧的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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