6周大強(qiáng)度訓(xùn)練對大鼠腎功能的影響及其機(jī)制*

牛衍龍，曹建民，周海濤，李 浩

（1.北京體育大學(xué)，北京100084，2.北京聯(lián)合大學(xué)，北京100023）

競技體育與軍事訓(xùn)練中，受訓(xùn)人員以長期大強(qiáng)度訓(xùn)練提高運(yùn)動(dòng)和作戰(zhàn)能力。由于負(fù)荷過大，超出機(jī)體的承受能力，且疲勞長時(shí)間得不到有效地恢復(fù)，極易引發(fā)過度訓(xùn)練綜合癥并導(dǎo)致腎臟損傷，表現(xiàn)為蛋白尿、血尿、電解質(zhì)紊亂等臨床癥狀［1］。運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的發(fā)生原理尚不完全清楚，目前認(rèn)為與外傷、酸性代謝產(chǎn)物的刺激、腎血管收縮造成的缺血及腎小球?yàn)V過屏障通透性改變等有關(guān)［2］。過度的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激可導(dǎo)致腎臟濾過屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生改變進(jìn)而功能下降，蛋白滲出后遠(yuǎn)超腎小管重吸收閾值（或伴有腎小管損傷），產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性蛋白尿［3］。裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）是腎臟濾過屏障三層膜中最重要和最具生物學(xué)活性的一部分，Nephrin作為SD的主要結(jié)構(gòu)蛋白，參與足細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)［4］。過度訓(xùn)練對腎臟組織中Nephrin的蛋白表達(dá)量的影響及其影響機(jī)制尚不清楚。研究表明［5］，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）參與蛋白尿的發(fā)生、炎癥反應(yīng)、腎小球硬化等的發(fā)生發(fā)展，其過度興奮可導(dǎo)致腎臟的不可逆損傷。本實(shí)驗(yàn)通過觀察6周大強(qiáng)度訓(xùn)練對大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的改變并檢測相關(guān)腎臟損傷標(biāo)志物的影響，判斷是否引發(fā)過度訓(xùn)練、運(yùn)動(dòng)性腎損傷及運(yùn)動(dòng)性蛋白尿；結(jié)合腎臟內(nèi)Nephrin蛋白的表達(dá)量及腎臟局部及循環(huán)系統(tǒng)血液中RAS指標(biāo)變化，探索長期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對腎臟結(jié)構(gòu)、功能的影響及運(yùn)動(dòng)性蛋白尿的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD雄性大鼠 36只（6周齡），體重（212.76±5.23），由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號 SCXK（京）2012-0001。隨機(jī)分為兩組：對照組（C組，n＝12）、大強(qiáng)度訓(xùn)練組（M，n＝24）。北京體育大學(xué)動(dòng)物房SPF級屏障環(huán)境下飼養(yǎng)，濕度 50%～70%，室溫 20°C～24°C。

1.2 訓(xùn)練方案

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后，C組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)，M組采用6周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6 d，每天訓(xùn)練1次。第4周起開始負(fù)重（體重的1%）并逐漸遞增（體重的6%），具體訓(xùn)練方案詳見表1［6］。若發(fā)現(xiàn)大鼠有力竭表現(xiàn)，即沉入水下10 s不能上浮，則托出水面休息5～10 min后再繼續(xù)游泳訓(xùn)練至完成訓(xùn)練方案。

Tab.1 Specific training protocol（s，n＝24）

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

訓(xùn)練結(jié)束后，受訓(xùn)練強(qiáng)度、頻度、負(fù)重情況、恢復(fù)時(shí)間等因素影響，M組大鼠出現(xiàn)意外死亡，僅剩21只。末次訓(xùn)練結(jié)束后30 min（此時(shí)蛋白尿排泄量最大）［7］隨機(jī)選取 C組與 M組大鼠各8只取單次尿液：將大鼠放在鋪有塑料薄膜的飼養(yǎng)籠中，待其排尿后，用加樣槍吸出放入至離心管中，3 000 r／min離心20 min，收集上清液待測。末次訓(xùn)練后24 h，C組、M組大鼠注射2%戊巴比妥鈉溶液2 ml麻醉，腹主靜脈取血，37℃自然凝固，待血清出現(xiàn)后放入冰箱24 h，3 000 r／min離心 10 min，分離制備血清，置-20℃冰箱中保存待測。取左側(cè)腎臟浸入4%多聚甲醛固定液中，右側(cè)腎臟剔除筋膜，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，迅速投入液氮暫存，隨后保存于-80℃冰箱凍存待測。

1.4 腎臟病理學(xué)變化測評

固定液中取出腎臟，洗滌12 h，梯度酒精脫水后透明，然后浸入石蠟包埋，4μm切片后HE染色，顯微鏡400倍鏡下觀察腎臟腎小球組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，并參照Paller標(biāo)準(zhǔn)［8］，隨機(jī)選擇5個(gè)視野中10個(gè)腎小管進(jìn)行腎臟損傷評分，由兩名技術(shù)員雙盲計(jì)算，取平均值。

1.5 其他指標(biāo)測試方法

比色法檢測尿總蛋白含量（total protein，TP），由Thermo Fisher Scientific公司提供；Elisa法檢測尿液微量白蛋白（microalbumin，mAlb）、大鼠尿液中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL），由上?？迫A生物工程股份有限公司和 CLOUD-CLONE CORP.提供，通過 Bio-RadxMark酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。KHB-1280全自動(dòng)生化儀檢測尿肌酐（urine creatinine，CRE）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），試劑盒由北京金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司和北京華英生物技術(shù)研究所提供。Western blot檢測腎臟Nephrin表達(dá)：將于-80℃保存的腎臟樣品取出研磨裂解，每孔道加等量蛋白經(jīng)6%SDS-PAGE分離電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氯乙烯膜。BSA封閉后一抗孵育過夜，洗滌后再二抗孵育?？贵w以及稀釋濃度為：Nephrin兔單克隆抗體（Sigma，PRS2265），稀釋濃度 1∶2 000；GAPDH鼠單克隆抗體（CST，D16H11），稀釋濃度1∶20 000。Thermo Pierce ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，X光暴露成像，采用軟件Image Lab 4.0進(jìn)行灰度分析。XH-6020全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀（西安核儀器廠提供）進(jìn)行放射免疫法測試：血清睪酮（testosterone，T）、皮質(zhì)酮（corticosterone，Cor）；腎素活性（renin activity，Ra）、血管緊張素（angiotensinⅡ，AngⅡ）分別取低溫保存腎臟小部分研磨定量后測定腎臟內(nèi)部Ra、AngⅡ，而循環(huán)系統(tǒng)中Ra、AngⅡ則取樣血清進(jìn)行測試，試劑盒均由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差（one-way ANOVA）分析。

2 結(jié)果

2.1 大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

C組大鼠腎小球內(nèi)血管系膜緊湊有致，血管球與囊腔壁界限明顯，血管內(nèi)紅細(xì)胞分布規(guī)律；M組大鼠腎臟腎小球囊腔和血管球出現(xiàn)嚴(yán)重膨大現(xiàn)象，血管系膜結(jié)構(gòu)破壞，血管球與囊腔壁界限模糊，小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性、管腔擴(kuò)張嚴(yán)重，管腔有少量脫落絨毛和上皮細(xì)胞，出現(xiàn)各種管型（圖1）。M組大鼠腎小管 Paller評分（14.01±3.53）顯著高于 C組（2.36±1.19）（P＜0.01）。

Fig.1 Glomerulus morphology in the two groups（HE×400）

2.2 大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對血清睪酮／皮質(zhì)酮的影響

M組血清睪酮較C組顯著降低（P＜0.01）；血清皮質(zhì)酮組間無顯著性變化；血清T／C，M組較C組顯著降低（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Comparison of serum testosterone／corticosterone between the two groups（±s，n＝12，21）

Tab.2 Comparison of serum testosterone／corticosterone between the two groups（±s，n＝12，21）

T：Testosterone；Cor：Corticosterone**P＜0.01 vs group C

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2.3 大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對尿液指標(biāo)的影響

M組尿液 TP、mAlb，NGAL顯著高于 C組（P＜0.01）；排除尿量對判定指標(biāo)的影響，M組 mAlb／CRE顯著高于 C組（P＜0.01，表 3）。

Tab.3 Changes of urine index induced by strength training（±s，n＝8）

Tab.3 Changes of urine index induced by strength training（±s，n＝8）

TP：Total protein；mAlb：Microalbumin；CRE：Creatinine；NGAL：Neutrophil gelatinase associated lipocalin**P＜0.01 vs group C

Group TP（μg／ml）mAlb（μg／L）CRE（μmol／L）mAlb／CRE（10-4）NGAL（ng／ml ）0.963±0.369 13.33±2.38 7598.8±1000.7 17.89±4.27 2.98±1.57 M 1.899±0.368** 19.15±3.23** 4123±634.6** 47.55±12.49** 13.04±6.25 C**

2.4 大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對腎臟損傷指標(biāo)的影響

血清 BUN、SCr，M組顯著高于 C組（P＜0.01，表 4）。

Tab.4 Comparison of renal injury index between the two groups（±s，n＝12，21）

Tab.4 Comparison of renal injury index between the two groups（±s，n＝12，21）

BUN：Blood urea nitrogen；SCr：Serum creatinine**P＜0.01 vs group C

Group BUN（mmol／L） SCr（μmol／L ）8.49±0.91 31.96±4.24 M 15.36±1.88** 80.39±11.87 C**

2.5 大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對腎臟組織Nephrin的影響

M組腎臟組織 Nephrin蛋白表達(dá)量（0.634±0.293）較 C組顯著降低（P＜0.01，圖 2）。

2.6 大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對腎臟局部和循環(huán)系統(tǒng)RAS相關(guān)指標(biāo)的影響

M組大鼠腎臟局部和循環(huán)系統(tǒng)中Ra，AngⅡ顯著性升高，明顯高于 C組（P＜0.01，表 5）。

Fig.2 Expression of nephrin and trend chart

Tab.5 RASindex in the two groups（±s，n＝12，21）

Tab.5 RASindex in the two groups（±s，n＝12，21）

RAS：Renin angiotensin system；iRa：Intrarenal Renin activity；iAngII：IntrarenalAngiotensinⅡ；cRa：Circulatory system renin activity；cAngII：Circulatory system angiotensinⅡ**P＜0.01 vs group C

Group iRa（ng／mg·h） iAngII（pg／mg） cRa（ng／ml·h） cAngII（pg／ml ）0.334±0.024 6.442±0.646 2.832±0.562 97.475±17.841 M 0.426±0.060** 7.932±1.103** 3.915±0.698** 128.670±19.682 C**

3 討論

睪酮與皮質(zhì)酮間的比值可以有效地反映機(jī)體分解和合成代謝的平衡狀況，是判斷機(jī)體出現(xiàn)過度訓(xùn)練綜合癥的重要指標(biāo)，M組大鼠睪酮與皮質(zhì)酮的比值較C組大鼠下降37%，超過了馮煒權(quán)教授等多位學(xué)者［9］提出的過度訓(xùn)練的診斷參考標(biāo)準(zhǔn)，說明6周的大強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)過度訓(xùn)練綜合征。尿TP是腎臟功能異常的最直接的檢測指標(biāo)。mAlb作為評估早期腎小球損傷的有效指標(biāo)之一，在腎小球壓力增加、濾過屏障受損或白蛋白吸收異常，排泄量會(huì)增加［10］。正常人體腎臟中NGAL的表達(dá)水平較低，但當(dāng)腎小管缺血性損傷時(shí)NGAL呈高表達(dá)，并在2 h內(nèi)出現(xiàn)于尿液［11］。檢測血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）變化可以進(jìn)一步明確腎損傷程度［12］。本實(shí)驗(yàn)說明6周的大強(qiáng)度訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性腎臟損傷及運(yùn)動(dòng)性蛋白尿。

Nephrin是特異的表達(dá)于足細(xì)胞的一種蛋白，對于維持腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)與功能完整性起關(guān)鍵作用。Nephrin表達(dá)減少可引起SD的組成發(fā)生改變，足突間的分子連接減少或中斷、足細(xì)胞損傷脫落，破壞腎小球?yàn)V過屏障、通透性增加，導(dǎo)致尿蛋白排出增加；此外Nephrin是足細(xì)胞重要的信號傳遞因子，其表達(dá)下調(diào)，可使細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞發(fā)生障礙，引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的進(jìn)一步破壞，從而形成惡性循環(huán)［13］。RAS活性的增加是腎臟功能異常與慢性腎臟疾病的重要誘因之一［14］，Ra和AngⅡ是RAS的主要效應(yīng)指標(biāo)，它們通過調(diào)節(jié)腎臟血管的緊張度和水、鈉的重吸收發(fā)揮其血流動(dòng)力學(xué)作用。AngⅡ的過度表達(dá)可以破壞SD結(jié)構(gòu)和功能的完整性，進(jìn)而引起腎小球損傷［15，16］。在糖尿病腎病和多種腎小球疾病狀態(tài)下，血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶抑制劑或AngⅡ受體拮抗劑可減輕足細(xì)胞損傷、穩(wěn)定Nephrin等SD結(jié)構(gòu)分子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中M組大鼠腎臟組織和循環(huán)系統(tǒng)血液中Ra、AngⅡ出現(xiàn)顯著升高，同時(shí)Nephrin表達(dá)下調(diào)明顯，說明6周大強(qiáng)度訓(xùn)練使得RAS在訓(xùn)練結(jié)束后24 h仍然處于高度興奮的狀態(tài)，AngⅡ隨著Ra增加同步升高，而Nephrin在腎臟內(nèi)部與循環(huán)血液中高濃度的AngⅡ作用下呈現(xiàn)持續(xù)性的低表達(dá)狀態(tài)。有研究表明［17］，一次性力竭運(yùn)動(dòng)可造成腎臟內(nèi)部Ra和AngⅡ升高，RAS興奮性增加，并腎靜脈進(jìn)入血液，以啟動(dòng)循環(huán)系統(tǒng)的RAS鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成循環(huán)系統(tǒng)血液中的Ra和AngⅡ增加。本實(shí)驗(yàn)采用的6周大強(qiáng)度訓(xùn)練方案造成運(yùn)動(dòng)性腎損傷的原因可能為過度訓(xùn)練引發(fā)運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注，在停止運(yùn)動(dòng)后腎臟內(nèi)Ra和AngⅡ升高的同時(shí)，不斷向血液中分泌，引起循環(huán)系統(tǒng)RAS活性隨之增加，且在損傷峰值點(diǎn)（停止運(yùn)動(dòng)后24 h）腎臟內(nèi)部與循環(huán)系統(tǒng)RAS均表現(xiàn)出較高的興奮狀態(tài)。持續(xù)興奮的RAS引發(fā)的高濃度AngⅡ作用于腎臟內(nèi)足細(xì)胞，導(dǎo)致Nephrin蛋白下調(diào)，SD出現(xiàn)異常，引發(fā)運(yùn)動(dòng)性腎損傷及運(yùn)動(dòng)性蛋白尿。然而本研究受條件所限，沒有針對運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)下腎臟內(nèi)部與循環(huán)系統(tǒng)中RAS的活性情況進(jìn)行深入和展開，有待進(jìn)一步研究。

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