P62基因?qū)盒院谏亓黾?xì)胞侵襲的影響及機(jī)制研究

易娟娟，招玉玲，謝蒲輝，唐妍，黃惠珍，鄭麗，蔡艷桃，楊競(jìng)，張晶，毛越蘋(píng)

（1.佛山市婦幼保健院 皮膚科，廣東 佛山 528000；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 皮膚科，廣東 廣州 510120）

惡性黑色素瘤發(fā)病率較低，但病死率非常高，主要是由于細(xì)胞生物惡性程度高，且極易侵襲、轉(zhuǎn)移。因而探索惡性黑色素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制顯得尤為重要，有助于為臨床靶點(diǎn)治療提供新的理論依據(jù)。

P62是一個(gè)經(jīng)典的自噬標(biāo)志基因，其在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。胰腺癌中，P62 與核轉(zhuǎn)錄因子NRF2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, NRF2）的激活可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞化療耐受[2]。卵巢癌中，P62 的聚集可以激活含半胱氨酸的天冬氨酸特異水解酶（cystine containing asparate specific protease-8, Caspase-8），從而促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展[3]。食管癌中，P62 蛋白受microRNA-487a 的靶擊，從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖[4]。此外，P62 在乳腺癌中可以通過(guò)穩(wěn)定癌基因MYC的信使RNA 從而維持腫瘤的干性特征，且P62 通過(guò)與波形蛋白Vimentin 相互作用促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[5-6]。另有報(bào)道，Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶VPS34 通過(guò)刺激P62 磷酸化參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[7]。上述報(bào)道表明，P62 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、生理功能中發(fā)揮著重要的作用。盡管如此，P62 在惡性黑色素瘤中的生理作用及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，P62 可以發(fā)揮促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化的作用，P62 也參與黑色素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)探討P62 在黑色素瘤細(xì)胞遷移、侵襲中的作用及其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375 細(xì)胞（購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，本實(shí)驗(yàn)室永久保存），DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司），胎牛血清（澳大利亞Gibco 公司），0.25%胰蛋白酶（澳大利亞Gibco 公司），Transwell 小室（美國(guó)Corning公司），結(jié)晶紫染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），二甲苯和中性樹(shù)膠（廣州鑫邦有限公司），OPTI-MEMI 培養(yǎng)液（澳大利亞Gibco 公司），日本尼康Ti-S 顯微鏡，干擾P62表達(dá)的siRNA（其序列為GCACAAAUUUGGUAAGUCA）及陰性對(duì)照siRNA（廣州銳博有限公司）。Western blotting 抗體如下： 兔抗β-catenin、兔抗c-Jun，鼠抗ZEB1，兔抗Axin、兔抗TCF4、兔抗c-Myc、兔抗P62、兔抗GAPDH、兔抗CCND1、兔二抗、鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人惡性黑色素瘤A375 細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳CO2條件下傳代培養(yǎng)。取處于70%對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d，分別將細(xì)胞按1.0×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，加入2 ml 含血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至≥55%融合。將干擾P62基因表達(dá)的siRNA 和陰性對(duì)照siRNA 轉(zhuǎn)染A375 細(xì)胞，分別作為干擾組和對(duì)照組。①分別取10μl/孔siRNA 溶液與無(wú)血清OPTI-MEMI培養(yǎng)基250μl/孔在2 ml EP 管中輕輕混勻（干擾組與對(duì)照組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，干擾組： siRNA-P62 溶液30μl+無(wú)血清OPTI-MEMI 培養(yǎng)基750μl；對(duì)照組： 陰性對(duì)照溶液30μl+無(wú)血清OPTI-MEMI 培養(yǎng)基750μl）。分別取陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑5μl/孔，與無(wú)血清OPTI-MEMI 培養(yǎng)基250μl/孔在另一個(gè)2 ml EP 管中輕輕混勻（干擾組與對(duì)照組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，干擾組： Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑15μl+無(wú)血清OPTI-MEMI 培養(yǎng)基750μl；對(duì)照組： Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑15μl+無(wú)血清OPTIMEMI 培養(yǎng)基750μl），兩組分別置于室溫下孵育5 min。②將上述孵育后的siRNA 混合液分別與孵育后的Lipofectamine 2000 混合液（即上述Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑+無(wú)血清OPTI-MEMI 培養(yǎng)基）輕輕混合，室溫條件下孵育20 min 以形成轉(zhuǎn)染混合物。③吸棄原6 孔板中的培養(yǎng)基，用PBS 洗2 遍，分別在每個(gè)孔中加入1.5 ml 新鮮含血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，將上述孵育后的混合液分別加入新DMEM 培養(yǎng)基的6孔板中。每組3個(gè)復(fù)孔。④將6孔板置于孵箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，6 h 后棄舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS 洗2 遍，換2 ml 含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基。24 h 后行Transwell 實(shí)驗(yàn)，48 h 后行Western blotting 檢測(cè)。

1.2.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染24 h 后取6 孔板干擾組和對(duì)照組細(xì)胞（選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染后黑色素瘤A375 細(xì)胞）。0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml（即每100μl 含1×105個(gè)細(xì)胞）。在配套的24 孔板加入500μl 含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，將Transwell 小室放進(jìn)24 孔中，確保沒(méi)有氣泡（每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔）。取無(wú)血清細(xì)胞懸液l00μl 加入Transwell小室的上室中，常規(guī)培養(yǎng)12 h（觀察5 ～10 個(gè)細(xì)胞穿膜），終止培養(yǎng)。取出上室，將未穿膜的上室內(nèi)細(xì)胞用濕棉簽擦去，甲醇固定細(xì)胞30 min。移到500μl結(jié)晶紫染液的孔中染色15 min。蒸餾水沖洗，將小室風(fēng)干，剪下小室膜，晾干，二甲苯和中性樹(shù)膠（比例1 ∶1）封片。干燥后于正顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍視野拍照，計(jì)算穿過(guò)Transwell 小室膜的平均細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 Western blotting取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染后48 h 的干擾組及對(duì)照組細(xì)胞，用PBS 溶液洗滌細(xì)胞3 次，在冰上加入放射免疫沉淀測(cè)定裂解液+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑（比例100 ∶1 ∶1）裂解細(xì)胞，孵育30 min，使細(xì)胞完全裂解、離心。留取適量上清測(cè)蛋白濃度，以蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取相同濃度的樣品加入Loading buffer金屬浴變性。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠。在電泳槽中加入變性后的樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（80 V，30 min；100 V，120 min），之后電轉(zhuǎn)移（350 mA，3 h）把目的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，洗膜，孵育一抗（濃度1 ∶1 000）過(guò)夜。第2 天，洗膜，孵育鼠二抗或兔二抗（濃度1 ∶5 000），加入顯色ECL 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光酶反應(yīng)底物，在化學(xué)發(fā)光儀上顯示目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P62 對(duì)黑色素瘤細(xì)胞穿膜的影響

兩組Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。干擾組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（54.33±4.16）×109個(gè)；對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（126.70±4.04）×109個(gè)（見(jiàn)圖2）。兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.620，P=0.000），干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組。

2.2 P62 對(duì)黑色素瘤A375 細(xì)胞Wnt/β-catenin及下游通路的影響

兩組P62、ZEB1、β-catenin、TCF4、c-Myc、c-Jun及CCND1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），干擾組低于對(duì)照組。見(jiàn)表1和圖3。

圖1 兩組Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （×200）

圖2 兩組Transwell 穿膜細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表1 兩組Wnt/β-catenin 及下游通路的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表1 兩組Wnt/β-catenin 及下游通路的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別 P62 ZEB1 β-catenin TCF4 c-Myc c-Jun CCND1干擾組 0.085±0.008 0.422±0.072 0.265±0.091 0.119±0.004 0.128±0.053 0.271±0.095 0.101±0.078對(duì)照組 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 t 值 198.103 13.905 13.990 381.484 28.497 13.291 19.963 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 P62 對(duì)Wnt/β-catenin 及下游通路的影響

3 討論

惡性黑色素瘤就診時(shí)往往已處于晚期，其生物惡性程度高，易侵襲、轉(zhuǎn)移，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后極差。關(guān)于惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制報(bào)道較多，但仍不足以闡明其具體的發(fā)病進(jìn)展過(guò)程。因此，探討黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制意義重大，有助于臨床開(kāi)發(fā)靶向治療藥物，改善黑色素瘤患者的總體預(yù)后。

P62 是一種經(jīng)典的自噬標(biāo)志物，參與多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控及自噬過(guò)程[1]，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的生理功能。Wnt/β-catenin 通路在動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生及其他生理過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用；同時(shí)與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。如果這條信號(hào)通路被異常激活，就可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生、發(fā)展。P62 與Wnt/β-catenin相關(guān)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9]、肝癌[10]、舌鱗癌[11]及卵巢癌[12]中的作用已有報(bào)道，然而在黑色素瘤中報(bào)道較少。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，P62可以促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖及周期轉(zhuǎn)化，表明P62在黑色素瘤中發(fā)揮癌基因的作用[8]。本研究結(jié)果顯示，干擾P62 表達(dá)后黑色素瘤細(xì)胞的遷移、侵襲數(shù)目減少，與前期報(bào)道[9-12]一致，進(jìn)一步支持P62 在黑色素瘤中發(fā)揮促癌因子的作用。

本研究進(jìn)一步探討P62 在黑色素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的具體機(jī)制。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，干擾P62 表達(dá)后的Wnt/β-catenin 經(jīng)典通路及下游相關(guān)因子（P62、β-catenin、TCF4、ZEB1、c-Myc、c-Jun 及CCND1）的表達(dá)均受抑制。TCF4 核轉(zhuǎn)錄因子是Wnt/β-catenin 經(jīng)典通路的關(guān)鍵下游因子。當(dāng)Wnt/β-catenin 通路被異常激活后，GSK3β/Axin/APC復(fù)合體降解β-catenin 受阻，導(dǎo)致胞漿內(nèi)β-catenin大量蓄積，引起β-catenin 穿核與TCF4 結(jié)合，誘導(dǎo)下游因子ZEB1、c-Myc、c-Jun 及CCND1 等的大量表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。因而本研究提示P62在促進(jìn)黑色素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin 相關(guān)通路及下游因子的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。下一步的研究需要繼續(xù)探索P62 調(diào)控Wnt/β-catenin 通路及下游相關(guān)因子表達(dá)的具體機(jī)制。

綜上所述，P62 可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 相關(guān)通路及下游因子發(fā)揮促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。將來(lái)需要進(jìn)一步研究P62 調(diào)控Wnt/β-catenin相關(guān)通路的具體機(jī)制。