lncRNA DLX6?AS1通過靶向miR?16?5p/NUCKS1調(diào)控皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431增殖、遷移和侵襲

鄭云鵬 蔡丙杰 李旭陽 李冬芹 尹光文

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科450052

長 鏈 非 編 碼RNA（long non ? coding RNAs，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）均屬于非編碼RNA，均參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［1］。皮膚鱗狀細(xì)胞癌（簡稱皮膚鱗癌）是常見的皮膚惡性腫瘤［2］，手術(shù)、放療和化療聯(lián)合治療是晚期皮膚鱗癌的經(jīng)典治療方式，靶向和免疫治療是其治療的新方式［3］。研究表明，lncRNA、miRNA可能在皮膚鱗癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用［4?5］。有報道顯示，長鏈非編碼生長停滯特異性蛋白6 反義RNA1（growth stasis specific protein 6 antisense RNA 1，lncRNA DLX6?AS1）在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其高表達(dá)與細(xì)胞增殖和侵襲有關(guān)［6?7］，但lncRNA DLX6?AS1在皮膚鱗癌中的作用尚不清楚。miR?16?5p在乳腺癌［8］和腎癌［9］中低表達(dá)，影響癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1（nuclear ubiquitous casein and cyclin ? dependent kinase substrate1，NUCKS1）在胃癌中高表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲［10］。我們通過在線工具starBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA DLX6?AS1和miR?16?5p存在結(jié)合位點，且NUCKS1可能是miR?16?5p的靶基因，然而miR?16?5p和NUCKS1在皮膚鱗癌中的表達(dá)和作用尚不清楚。因此，我們探討lncRNA DLX6?AS1靶向miR?16?5p/NUCKS1對皮膚鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

材料與方法

一、材料

人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞（細(xì)胞株號CVCL_0038）和皮膚鱗癌A431 細(xì)胞（細(xì)胞株號CVCL_0037）產(chǎn)自美國模式培養(yǎng)物集存庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（美國Hyclon 公司），NUCKS1抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2 抗體和MMP9 抗體（美國Santa cruze公司），山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（HRP，北京百奧萊博科技有限公司）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、Total RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR［qRT?PCR試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司］，雙熒光素酶報告系統(tǒng)（dual?luciferase reporter assay system）（美國Promega 公司），lncRNA DLX6?AS1 抑制物（si?DLX6?AS1，5′?GATCGTAGGCTAACACATCCATGG AATCAAGAGTTCCATGGATGTGTTAGCCTATTTTT TGA?3′）、miR?16?5p 模擬物（miR?16?5p，5′?GCGGTTATAAATGCACGACGAT?3′）、miR?16?5p抑制物（anti?miR?16?5p，5′?CACCAATATTTACGTGCT GCTA?3′）、NUCKS1抑制物（si?NUCKS1，5′?GAAGG TTGTTGATTACTCACAGTTT ? 3′）和 相 應(yīng) 對 照［DLX6?AS1?NC（5′?GATCGATCCGATGTCGGTATA AGAACTCAAGAGGTTCTTATACCGACATCGGATT TTTTTGA?3′）、miR?NC（5′?ATTTGCCAGGTCGGAA TG?3′）、anti?miR?NC（5′?UCACAACCUCCUAG AAAGAGUAGA?3′）、NUCKS1?NC（5′?CTAGTACTT ACGTTATGGAAGTTTG?3′）］（上海吉瑪制藥有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司），CCK8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、β肌動蛋白抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），全自動酶標(biāo)儀和Real?time PCR儀（美國Bio?Rad公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

將A431細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞分別培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，1∶3消化傳代。

三、qRT?PCR 檢測lncRNA DLX6?AS1、miR?16?5p和NUCKS1mRNA的表達(dá)

取對數(shù)生長期HaCaT 和A431 細(xì)胞，用Total RNA提取試劑盒提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA 為模板，按照實時熒光定量PCR 試劑盒說明書操作，以U6 或GAPDH為內(nèi)參，檢測lncRNA DLX6?AS1、miR ? 16 ? 5p 和NUCKS1 mRNA的表達(dá)。引物由上海吉瑪制藥有限公司合成，序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40 個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法分析HaCaT和A431細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DLX6?AS1、miR?16?5p和NUCKS1 mRNA的相對表達(dá)。

四、Western 印 跡 檢 測NUCKS1、Cyclin D1、MMP?2和MMP?9蛋白的相對表達(dá)水平

取對數(shù)生長期HaCaT 和A431 細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA 法對蛋白進(jìn)行定量。目的蛋白沸水浴變性處理，取上清液上樣電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜轉(zhuǎn)移至NUCKS1 抗體、Cyclin D1抗體、MMP2抗體、MMP9抗體和β肌動蛋白抗體（1∶1 000 稀釋）溶液，于4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜3 次，將膜轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的山羊抗兔IgG?HRP二抗稀釋液（1∶1 000）中，孵育2 h。通過超敏ECL發(fā)光試劑盒顯影、定影、曝光。使用Quantity One 4.6 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶與β肌動蛋白條帶的比值表示蛋白的相對表達(dá)水平。

五、雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗

用starBase 預(yù)測DLX6?AS1 與miR?16?5p 及miR?16?5p 和NUCKS1 之間的互補序列，根據(jù)互補序列設(shè)計合成有互補結(jié)合位點的WT?DLX6?AS1、WT?NUCKS1序列和無互補結(jié)合位點的MUT?DLX6?AS1、MUT?NUCKS1 序列（圖1），并通過DNA 連接酶將其克隆至熒光載體上，構(gòu)建熒光素酶報告基因質(zhì)粒（上海吉瑪制藥有限公司），根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別與miR?16?5p、miR?NC共轉(zhuǎn)染至A431 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒要求操作，檢測細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以二者的比值表示報告DLX6?AS1基因的表達(dá)水平。

六、調(diào)節(jié)DLX6?AS1、miR?16?5p、NUCKS1 的表達(dá)對A431細(xì)胞的影響

用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期A431細(xì)胞，以1×l06/ml 接種于6 孔板，根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染si?DLX6?AS1、si?NUCKS1 干擾A431細(xì)胞DLX6?AS1、NUCKS1表達(dá)，分別轉(zhuǎn)染miR?16?5p、anti?miR?16?5p 上調(diào)和敲減A431 細(xì)胞miR?16?5p 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染8 h 后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用qRT?PCR和Western 印跡檢測轉(zhuǎn)染效率，確定轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)實驗研究。

表1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR引物信息

圖1 根據(jù)長鏈非編碼RNA DLX6?AS1 與微小RNA?16?5p（miR?16?5p）之間和miR?16?5p與NUCKS1之間的互補序列設(shè)計的序列 1A：長鏈非編碼RNA DLX6?AS1與微小RNA?16?5p（miR?16?5p）之間的互補核苷酸序列；1B：miR?16?5p與NUCKS1之間的互補核苷酸序列。WT序列為有互補結(jié)合位點的序列；MUT序列為無互補結(jié)合位點的序列

1.干擾DLX6?AS1表達(dá)對A431細(xì)胞的影響：取轉(zhuǎn)染si?DLX6?AS1、DLX6?AS1?NC 的A431 細(xì)胞，采用qRT?PCR 檢測miR?16?5p、NUCKS1 mRNA 的表達(dá)，CCK8實驗檢測細(xì)胞存活率，Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，Western 印跡檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP?9的相對表達(dá)水平。

CCK8實驗：取各組A431細(xì)胞，稀釋為2×104/ml，以100 μl/孔接種于96 微孔板中，每孔加入10 μl CCK8溶液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度（A 值）。細(xì)胞存活率=實驗組A 值/對照組A值×100%。

Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力：遷移實驗中，取各組A431 細(xì)胞，棄上清液，用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，饑餓培養(yǎng)過夜，收集細(xì)胞，稀釋為2×105/ml，取100 μl 細(xì)胞加入Transwell 上層小室，下層加入含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，棉簽拭去上層小室未遷移的細(xì)胞，采用甲醛固定遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，拍照，顯微鏡下計數(shù)10個200倍視野，計算各組的遷移細(xì)胞均數(shù)。侵襲實驗中，將Transwell 上層小室的培養(yǎng)液更換為1∶6 比例稀釋的Matrigel基質(zhì)，余步驟同遷移實驗。

2.過表達(dá)miR?16?5p對A431細(xì)胞的影響：取轉(zhuǎn)染miR?16?5p、miR?NC的A431細(xì)胞，采用qRT?PCR檢測miR?16?5p 的表達(dá)，CCK8 實驗檢測細(xì)胞存活率，Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，Western 印跡法檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9的相對表達(dá)水平。

3. 敲低NUCKS1 對A431 細(xì)胞的影響：取轉(zhuǎn)染si?NUCKS1、NUCKS1?NC 的A431 細(xì)胞，分別采用CCK8 實驗檢測細(xì)胞存活率，Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，Western 印跡檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9的相對表達(dá)水平。

4.低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1后敲減miR?16?5p對A431細(xì)胞的影響：取轉(zhuǎn)染si?DLX6?AS1后分別轉(zhuǎn)染anti?miR?16?5p、anti?miR?NC 的A431 細(xì)胞，采用qRT?PCR 檢測miR?16?5p 的表達(dá)，CCK8 實驗檢測細(xì)胞存活率，Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，Western 印跡檢測Cyclin D1、MMP2 和MMP9 的相對表達(dá)水平。

5.低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1、敲減miR?16?5p后抑制NUCKS1 對A431 細(xì)胞的影響：取轉(zhuǎn)染si?DLX6?AS1 和anti?miR?16?5p 后分別轉(zhuǎn)染si?NUCKS1、NUCKS1?NC 的A431 細(xì) 胞，分 別 采 用CCK8 實驗檢測細(xì)胞存活率，Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，Western 印跡檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9的相對表達(dá)水平。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS21.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以±s 表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、A431 與HaCaT 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DLX6?AS1、miR?16?5p、NUCKS1的表達(dá)

A431細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DLX6?AS1的相對表達(dá)水平高于HaCaT 細(xì)胞（P<0.001），miR?16?5p 的相對表達(dá)水平低于HaCaT 細(xì)胞（P < 0.001），NUCKS1 mRNA 和蛋白的相對表達(dá)高于HaCaT 細(xì)胞（均P<0.001）。見圖2、表2。

二、雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證lncRNA DLX6?AS1 與miR?16?5p、miR?16?5p 與NUCKS1 的靶向結(jié)合能力

共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T?DLX6?AS1后，miR?16?5p組細(xì)胞相對熒光素酶活性低于miR?NC 組（t = 14.87，P <0.05）；共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T?NUCKS1后，miR?16?5p組細(xì)胞相對熒光素酶活性亦低于miR?NC 組（t = 12.94，P <0.05）；而共轉(zhuǎn)染MUT?DLX6?AS1、MUT?NUCKS1后，miR?16?5p組細(xì)胞相對熒光素酶活性與miR?NC組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

三、低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1 對A431 細(xì)胞的影響

si?DLX6?AS1 組細(xì)胞DLX6?AS1 表達(dá)水平（0.30 ± 0.03）低于DLX6?AS1?NC 組（1.00 ± 0.11，t = 18.42，P < 0.001），miR?16?5p 表達(dá)水平（3.01 ±0.31）高于DLX6?AS1?NC 組（1.02±0.10，t=18.33，P < 0.001），細(xì)胞存活率（55.13% ± 5.50%）低于DLX6?AS1?NC組（100.27%±10.05%，t=11.82，P<0.001）；si?DLX6?AS1 組細(xì)胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表達(dá)量均低于DLX6?AS1?NC組（均P<0.05，圖4A、4B），細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)亦低于DLX6?AS1?NC組（均P<0.05，圖4C、4D）。

四、高表達(dá)miR?16?5p對A431細(xì)胞的影響

圖2 Western 印跡檢測HaCaT 和A431 細(xì)胞中NUCKS1 的表達(dá) A431細(xì)胞中NUCKS1蛋白表達(dá)水平高于HaCaT細(xì)胞

表2 HaCaT和A431細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DLX6?AS1、miR?16?5p和NUCKS1 mRNA及蛋白的表達(dá)比較（±s）

表2 HaCaT和A431細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DLX6?AS1、miR?16?5p和NUCKS1 mRNA及蛋白的表達(dá)比較（±s）

注：n=9

組別HaCaT細(xì)胞A431細(xì)胞t值P值lncRNA DLX6?AS1 1.00±0.10 2.43±0.24 16.50<0.001 miR?16?5p 1.05±0.11 0.28±0.03 20.26<0.001 NUCKS1 mRNA 1.04±0.12 3.76±0.38 20.48<0.001 NUCKS1蛋白0.36±0.04 0.89±0.09 16.14<0.001

miR?16?5p 組A431 細(xì)胞miR?16?5p 表達(dá)水平（3.56 ± 0.36）高 于miR?NC 組（1.00 ± 0.12，t =20.24，P < 0.05），細(xì)胞存活率（65.73% ± 6.58%）低于miR?NC 組（100.27% ± 10.05%，t = 8.62，P <0.05）；miR?16?5p 組NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 表達(dá)水平均低于miR?NC 組（均P<0.05，圖5A、5B），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)亦低于miR?NC 組（均P<0.05，圖5C、5D）。

五、敲低NUCKS1對A431細(xì)胞的影響

si?NUCKS1組細(xì)胞存活率（54.03%±5.40%）低于NUCKS1?NC 組（100.10% ± 10.01%，t = 12.15，P < 0.05）；si?NUCKS1 組細(xì)胞中NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 表達(dá)水平均低于NUCKS1?NC組（均P<0.05，圖6A、6B），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)亦低于NUCKS1?NC組（均P<0.05，圖6C、6D）。

六、低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1 后敲減miR?16?5p對A431細(xì)胞的影響

共轉(zhuǎn)染si?DLX6?AS1后，anti?miR?16?5p組miR?16?5p 表達(dá)水平（0.34 ± 0.04）低于anti?miR?NC 組（1.00 ± 0.12，t = 15.65，P < 0.05），細(xì)胞存活率（137.33%±13.75%）高于anti?miR?NC組（100.35%±10.05%，t = 6.51，P < 0.05），anti?miR?16?5p 組Cyclin D1、MMP2 和MMP9 相對表達(dá)水平均高于anti?miR?NC 組（均P < 0.05，圖7A、7B），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均高于anti?miR?NC 組（P < 0.05，圖7C、7D）。

七、低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1、敲減miR?16?5p后抑制NUCKS1表達(dá)對A431細(xì)胞的影響

低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1、敲減miR?16?5p后，si?NUCKS1 組細(xì)胞存活率（73.86% ± 7.38%）低于NUCKS1?NC 組（137.33% ± 13.75%，t = 12.20，P <0.05）；si?NUCKS1 組NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表達(dá)量均低于NUCKS1?NC 組（P <0.05，圖8A、8B），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于NUCKS1?NC組（P<0.05，圖8C、8D）。

圖3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證lncRNA DLX6?AS1與miR?16?5p（3A）及miR?16?5p與NUCKS1（3B）的靶向結(jié)合能力 a：miR?NC組與miR?16?5p組比較，P<0.05

圖4 干擾lncRNA DLX6?AS1表達(dá)對A431細(xì)胞的影響 4A、4B：Western印跡檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相對水平的代表電泳圖和統(tǒng)計圖；4C、4D：Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的代表性細(xì)胞圖和統(tǒng)計圖。a：n=9，兩組比較，P<0.05。lncRNA DLX6?AS1：長鏈非編碼生長停滯特異性蛋白6反義RNA1；NUCKS1：核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白D1；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

圖5 轉(zhuǎn)染miR?16?5p對A431細(xì)胞的影響 5A、5B：Western印跡檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相對水平的代表電泳圖和統(tǒng)計圖；5C、5D：Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的代表性細(xì)胞圖和統(tǒng)計圖。a：n=9，兩組比較，P<0.05。NUCKS1：核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白D1；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

圖6 敲低NUCKS1的表達(dá)對A431細(xì)胞的影響 6A、6B：Western印跡檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相對水平的代表電泳圖和統(tǒng)計圖；6C、6D：Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的代表性細(xì)胞圖和統(tǒng)計圖。a：n=9，兩組比較，P<0.05。NUCKS1：核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白D1；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

圖7 低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1后敲減miR?16?5p對A431細(xì)胞的影響 7A、7B：Western印跡檢測Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平的代表電泳圖和統(tǒng)計圖；7C、7D：Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的代表性細(xì)胞圖和統(tǒng)計圖。a：n=9，兩組比較，P<0.05。lncRNA DLX6?AS1：長鏈非編碼生長停滯特異性蛋白6反義RNA1；NUCKS1：核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白D1；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

圖8 低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1、敲減miR?16?5p 后抑制NUCKS1 表達(dá)對A431 的影響 8A、8B：Western 印跡檢測NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相對表達(dá)水平的代表電泳圖和統(tǒng)計圖；8C、8D：Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的代表性細(xì)胞圖和統(tǒng)計圖。a：n=9，兩組比較，P<0.05。lncRNA DLX6?AS1：長鏈非編碼生長停滯特異性蛋白6反義RNA1；NUCKS1：核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白D1；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

討 論

以往研究顯示，lncRNA DLX6?AS1、miR?16?5p、NUCKS1 在多種癌癥中異常表達(dá)，可參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展，然而其對皮膚鱗癌的影響還不清楚。本研究檢測lncRNA DLX6?AS1、miR?16?5p 和NUCKS1 在HaCaT 與A431 細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，lncRNA DLX6?AS1、NUCKS1 在A431 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而miR?16?5p下調(diào)表達(dá)，提示其可能具有相關(guān)性。為研究它們之間是否具有相互作用關(guān)系，我們通過starBase 預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR?16?5p 與lncRNA DLX6?AS1以及NUCKS1均有結(jié)合位點，推測lncRNA DLX6?AS1 可能靶向調(diào)控miR?16?5p，而miR?16?5p 可能靶向調(diào)控NUCKS1，進(jìn)一步通過雙熒光素酶報告實驗進(jìn)行驗證，證實了starBase 預(yù)測的結(jié)合關(guān)系。

為進(jìn)一步研究lncRNA DLX6?AS1 對鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們干擾lncRNA DLX6?AS1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖及遷移和侵襲活性降低。Cyclin D1 是細(xì)胞周期正調(diào)控相關(guān)蛋白，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)［11］；MMP2 和MMP9 是細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白，其表達(dá)水平與細(xì)胞遷移、侵襲呈正相關(guān)［12］。結(jié)果提示，低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1 可抑制皮膚鱗癌增殖和轉(zhuǎn)移。既往文獻(xiàn)報道在食管鱗癌中l(wèi)ncRNA DLX6?AS1 表達(dá)上調(diào)，敲除lncRNA DLX6?AS1可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。本實驗結(jié)果與既往研究結(jié)果相符。

已有研究證實，miR?16?5p 在脊索瘤［14］、乳腺癌［15］、肝癌［16］等惡性腫瘤中均表達(dá)下調(diào)，且調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究通過調(diào)控miR?16?5p 的表達(dá)探討其對皮膚鱗癌細(xì)胞的影響，過表達(dá)miR?16?5p 后Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖及遷移和侵襲活性降低，提示過表達(dá)miR?16?5p可抑制A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究表明，lncRNA DLX6?AS1 靶向調(diào)控miR?16?5p，而敲減miR?16?5p 的同時低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1，Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖及遷移和侵襲活性升高，說明敲減miR?16?5p 逆轉(zhuǎn)了低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1對A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進(jìn)一步表明lncRNA DLX6?AS1 可能通過靶向負(fù)調(diào)控miR?16?5p影響A431細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，NUCKS1在A431細(xì)胞中高表達(dá)，與肝細(xì)胞癌［17］、宮頸鱗癌［18］中的表達(dá)趨勢相同。為研究NUCKS1 對A431 細(xì)胞的影響，我們抑制NUCKS1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)A431細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲亦受到抑制，說明NUCKS1在皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)NUCKS1 可部分逆轉(zhuǎn)敲減miR?16?5p 和lncRNA DLX6?AS1 低表達(dá)對A431 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，根據(jù)以上結(jié)果，推測在皮膚鱗癌中l(wèi)ncRNA DLX6?AS1通過調(diào)控miR?16?5p/NUCKS1發(fā)揮致癌作用。

綜上，本研究表明，低表達(dá)lncRNA DLX6?AS1可通過靶向上調(diào)miR?16?5p進(jìn)而下調(diào)NUCKS1的表達(dá)，抑制A431細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究的不足之處為只針對皮膚鱗癌細(xì)胞A431進(jìn)行了體外研究，未進(jìn)行相應(yīng)的動物實驗，后續(xù)將進(jìn)行相應(yīng)的動物體內(nèi)實驗，為皮膚鱗癌的臨床研究提供更多的數(shù)據(jù)支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突