腦得生片的HPLC指紋圖譜研究

張永萍，李永鵬

（1.青海省海東市食品藥品和質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，青海 810600； 2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，青海 810000）

腦得生片臨床用于治療腦動(dòng)脈硬化、缺血性腦卒中和腦出血后遺癥等，已有文獻(xiàn)研究了葛根、紅花、三七、川芎和山楂等藥材的活性成分［1］，鮮見(jiàn)腦得生片中葛根摻偽的研究，葛根黃酮是葛根的主要功效成分，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管和腦血管以及促進(jìn)血液循環(huán)等多種藥理作用［2］。

通過(guò)前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)目前市場(chǎng)中葛根的主要摻偽品為粉葛，兩者在2000年版《中國(guó)藥典》中均為葛根來(lái)源。由于兩者的成分相近但含量差異較大，2005年版《中國(guó)藥典》起葛根單指野葛的根，而甘葛藤則作為粉葛的來(lái)源單列。葛根和粉葛的成分鑒別現(xiàn)有文獻(xiàn)較多［3－8］，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腦得生片中葛根只規(guī)定了以葛根素為對(duì)照的薄層色譜鑒別方法，不能有效控制粉葛的摻偽。本研究以葛根摻偽研究為目的，采用HPLC法建立了腦得生片的指紋圖譜，為該中成藥有效成分的測(cè)定以及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)［9－11］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津2030高效液相色譜儀（島津公司），二極管陣列檢測(cè)器；Milli-QA10超純水器（德國(guó)默克密理博公司）；BSA224SCW型十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯公司）；EVELA1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化機(jī)械株式會(huì)社）；K-600DE型數(shù)控超聲波儀（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；Chempattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件（北京科邁恩科技有限公司）。

1.2 試藥 葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-200912）、3′-羥基葛根素對(duì)照品（批號(hào)161119）、3′-甲氧基葛根素對(duì)照品（批號(hào)160705）、大豆苷對(duì)照品（批號(hào)111738-201603）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。水為Milli-Q純化水，甲醇為默克公司色譜純。

1.3 樣品 100批腦得生片樣品均來(lái)自2017年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)計(jì)劃抽驗(yàn)樣品，10批葛根和10批粉葛藥材均購(gòu)于藥材市場(chǎng)，經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院中藥室主任藥師劉亞蓉鑒定，葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd）Ohwi的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%甲酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～30 min，5%A；30～60 min，5%A→15%A；60～170 min，15%A→20%A；170～210 min，20%A→40%A），檢測(cè)波長(zhǎng)為 250 nm，流速 1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量 10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素和大豆苷對(duì)照品適量，分別置25 ml量瓶中，用25%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度分別為 2.052、1.928、1.424和1.862 mg/ml的溶液，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別取上述4種成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 ml，置同一10 ml量瓶中，加25%甲醇配制成上述4種成分濃度分別為205.2、192.8、142.4和186.2 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 藥材溶液的制備 取葛根細(xì)粉0.4 g、粉葛細(xì)粉0.4 g，精密稱(chēng)定，分別置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取腦得生片研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置100 ml錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25 ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得HPLC供試品溶液。取上述溶液2 ml，置200 ml量瓶中，加25%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 按腦得生片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)下的處方和生產(chǎn)工藝制備不含葛根的陰性樣品，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一腦得生片供試品溶液（吉林松遼，批號(hào) 20170101）10 μl，按上述液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖，以葛根素峰為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素和大豆苷的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為 0.35%、1.67%和0.72%（n=6），相對(duì)峰面積RSD分別為1.59%、1.09%和1.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一腦得生片供試品（吉林松遼，批號(hào)20170101）6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以葛根素峰為參照峰，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為0.39%、1.41%和1.44%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD分別為1.14%、1.05%和1.35%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一腦得生片供試品溶液（吉林松遼，批號(hào) 20170101）10 μl，分別在制備 0、4、8、12、24和36 h后按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以葛根素峰為參照，計(jì)算特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為1.84%、1.11%和0.35%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD分別為1.72%、1.09%和1.58%（n=6），表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 特征峰歸屬 精密吸取陰性對(duì)照品溶液、粉葛藥材溶液、葛根藥材溶液和供試品溶液（吉林松遼，批號(hào)20170101）各 10 μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖 1。

圖1 陰性樣品（A）對(duì)照品（B）葛根藥材（C）粉葛藥材（D）供試品（E）HPLC色譜圖

2.3.5 指紋圖譜的建立 對(duì)本次收集到100批腦得生片樣品、10批粉葛樣品和10批葛根樣品，按“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖（見(jiàn)圖2）。根據(jù)結(jié)果，采用Chempattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，生成腦得生片共有模式的對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖3。共有峰6個(gè)。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，其標(biāo)定1號(hào)峰為3′-羥基葛根素、2號(hào)峰為葛根素、3號(hào)峰為3′-甲氧基葛根素、4號(hào)峰為大豆苷，其他峰為未知成分。

圖2 100批腦得生片HPLC對(duì)照指紋圖譜（從上到下分別為樣品1～100）

圖3 腦得生片HPLC對(duì)照指紋圖譜

2.3.6 指紋圖譜數(shù)據(jù)評(píng)價(jià) 采用Chempattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件以指紋圖譜為參照，計(jì)算1～100批次腦得生片樣品、10批粉葛樣品和10批葛根樣品相似度，相似度圖譜見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，所有批次腦得生片相似度均大于0.9，相似度較好。

圖4 腦得生片相似度分析圖

2.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析 采用Chempattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件對(duì)腦得生片數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)量學(xué)分析。

2.4.1 聚類(lèi)分析 將100批腦得生樣品、10批粉葛樣品和10批葛根樣品的指紋圖譜導(dǎo)入Chempattern軟件中，采用多元統(tǒng)計(jì)分析法，分析參數(shù)選擇歐氏距離進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果所有樣品分為兩個(gè)聚群，其中10批次粉葛與2批次云南龍發(fā)樣品在一個(gè)聚群中，98批次樣品與10批次葛根在一個(gè)聚群中，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

2.4.2 主成分分析 主成分分析（PCA）是一種非參數(shù)分析方法，通過(guò)多維度有效觀測(cè)樣品特征貢獻(xiàn)率。為了綜合評(píng)價(jià)腦得生片的質(zhì)量，將100批腦得生樣品和10批粉葛樣品、10批葛根樣品峰面積采用Chempattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果腦得生葵花764、葵花406、葵花943、紅豆杉345產(chǎn)生明顯偏離，10批粉葛樣品也向一側(cè)偏離。其余樣品基本聚群。其中葛根素峰對(duì)樣品葵花764、葵花406、葵花943，紅豆杉345偏離貢獻(xiàn)大，3-甲氧基葛根素對(duì)粉葛樣偏離貢獻(xiàn)大。與聚類(lèi)分析結(jié)果相一致。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 本文采用梯度洗脫分離腦得生片中的4種成分分離效果良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。本文通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190～400 nm），結(jié)果250 nm時(shí)4種化學(xué)成分均有較大吸收，且雜質(zhì)成分干擾少，故選擇250 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相優(yōu)化時(shí)分別考查了甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-磷酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)，最終在甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)色譜分離度好，故選擇此流動(dòng)相。

3.2 指紋圖譜分析 100批腦得生片均含有4個(gè)特征峰，雖然各批次間有一定差異，但相似度均在0.90以上，其中兩批云南龍發(fā)樣品相似度相對(duì)較低，故加入葛根和粉葛藥材樣品和腦得生指紋圖譜比較，云南龍發(fā)兩批樣品與粉葛指紋圖譜相似度接近，聚類(lèi)分析時(shí)在一個(gè)聚群，主成分分析結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，疑似粉葛投料。表明該方法具有較好的一致性，可作為腦得生片質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

本試驗(yàn)在同一色譜條件下，建立了腦得生片的指紋圖譜，對(duì)100批樣品指紋圖譜進(jìn)行了測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，為有效控制腦得生片質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。