根管內(nèi)壁交聯(lián)殼聚糖納米顆粒對(duì)纖維樁粘接質(zhì)量的影響*

熊 潔 諶禮佩 江青松

膠原纖維的穩(wěn)定性對(duì)于脫礦牙本質(zhì)表面的粘接界面完整性具有巨大影響，尤其在多年行使功能后尤為重要[1]。粘接劑層下暴露的牙本質(zhì)膠原纖維易于受到細(xì)菌和宿主源性的金屬基質(zhì)蛋白酶的攻擊，成為粘接持久性的薄弱環(huán)節(jié)[2,3]。近年來(lái)，研究者對(duì)于提高粘接界面穩(wěn)定性進(jìn)行了多種方法的嘗試，交聯(lián)劑的使用被證明具有明顯積極影響[4-7]。它可以通過(guò)分子內(nèi)和分子間的聯(lián)結(jié)提高膠原纖維的機(jī)械和生物穩(wěn)定性，從而穩(wěn)定粘接界面。戊二醛是一種最有效并廣泛使用的交聯(lián)劑，但是，其殘余物具有很高毒性，無(wú)法用于人體[8,9]。碳二亞胺（EDC）作為一種無(wú)毒的交聯(lián)劑也出現(xiàn)在許多研究中，但其作用較弱[10,11]。交聯(lián)技術(shù)可以用于將天然生物聚合物整合至膠原纖維中以提高機(jī)械性能[12-14]，殼聚糖就是其中之一[15,16]。殼聚糖是一種具有多種性能的親水性聚合物,其大量的羥基與氨基基團(tuán)可以與膠原及膠原酶形成化學(xué)結(jié)合,直接阻止膠原纖維上與酶的結(jié)合位點(diǎn)或是直接抑制膠原酶的活性,從而直接提高纖維的抗降解性能[17];同時(shí),它也可以粘接至具有負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞,改變了細(xì)胞膜的通透性直至死亡,因此具有抗菌性能[18,19]。已有研究證實(shí)Csnp處理的交聯(lián)牙本質(zhì)膠原纖維展現(xiàn)出更好的機(jī)械屬性和更高的抗酶解性[13]。根管內(nèi)纖維樁的粘接界面在長(zhǎng)期使用后容易出現(xiàn)纖維降解,形成細(xì)菌的侵入通道,更進(jìn)一步加劇粘接界面完整性的破壞。因此,本研究旨在觀察根管牙本質(zhì)在Csnp和EDC的作用下對(duì)纖維樁在根管內(nèi)的粘接質(zhì)量的影響。

1.材料與方法

1.1 牙體收集 收集38顆單根管離體人牙,納入標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)齲壞、無(wú)裂紋的上頜前牙及單根管的前磨牙,消毒后置于4 ℃氯化鈉溶液中,三個(gè)月內(nèi)使用。

1.2 根管預(yù)備和樁道預(yù)備 在釉牙骨質(zhì)界處去除牙冠部,清理通暢根管,10#K（馬尼,Tichigi,日本）鉆確認(rèn)工作長(zhǎng)度,鎳鈦Protaper（登士柏,瑞士）預(yù)備根管至F3后用Macro-lock標(biāo)準(zhǔn)鉆（RTD,法國(guó)）預(yù)備樁道至#4,每次更換鉆時(shí)以1%NaCIO和17%EDTA交替沖洗,最后大量生理鹽水沖洗待用。

1.3 試劑制備 所有化學(xué)試劑均購(gòu)于Sigma公司。Csnp是基于前期研究文獻(xiàn)合成[20],溶于去離子水中,形成1 mg/ml溶液。細(xì)菌酶（P/N C-0130）溶于含0.36mM CaCl2的50mM HEPES 緩沖液中,形成0.1 mg/ml酶溶液。33mM交聯(lián)劑EDC、8mM NHS以及50mM的MES緩沖液溶于40%的乙醇中,形成EDC交聯(lián)劑溶液。

1.4 試件處理 所有牙根以32%磷酸（UNIETCH,Bisco,美國(guó)）酸蝕15s,沖洗20s,吹干,隨機(jī)選取2顆牙根,分別進(jìn)行Csnp預(yù)處理：A：將牙根靜置于Csnp溶液中1 min后輕輕沖洗;B：將牙根置于Csnp溶液中超聲作用1 min后輕輕沖洗,隨后均經(jīng)EDC交聯(lián)劑作用24h,然后沖洗10s。抽真空干燥后,噴金,進(jìn)行電鏡觀察。其余牙根進(jìn)行粘接試件處理：根據(jù)粘接劑處理方式不同36顆牙分為三組（n=12）：A：浸泡在戊二醛溶液中24h;B在Csnp溶液中超聲作用1 min,輕輕沖洗,浸泡至EDC中24h,沖洗;C：無(wú)預(yù)處理（對(duì)照組）。分組處理完成后,使用商品粘接劑All-Bond 3A、B液均勻混合,小毛刷涂粘接劑20s,氣槍輕吹15s后光照固化,之后使用Duo-link（Bisco,Schaumburg,美國(guó)）進(jìn)行根管內(nèi)纖維樁（Macro-lock,RTD,法國(guó)）粘接。所有粘接操作由同一人完成。固化后,所有樣本置于去離子水中24h后進(jìn)行粘接質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

1.5 粘接質(zhì)量的評(píng)價(jià)

1.5.1 粘接界面電鏡觀察 每組取一個(gè)牙根橫向切割1 mm厚牙片4片進(jìn)行界面觀察。所有試件進(jìn)行酸蝕、沖洗、然后置于5%次氯酸鈉溶液10 min,沖洗20s。梯度酒精脫水后吹干,進(jìn)行SEM評(píng)估。

1.5.2 原位聚合轉(zhuǎn)化率（DC）每組取2個(gè)牙根,每個(gè)牙根水平向切割出4片1.0 mm左右厚度的薄片進(jìn)行粘接劑聚合轉(zhuǎn)化率的評(píng)價(jià)。將切片依次在600,800, 1500目砂紙上進(jìn)行打磨后,使用5.25%次氯酸鈉擦拭,超聲清潔10 min,然后保存24h后置于拉曼光譜顯微鏡（LabRAM HR Evolution, Horiba Scientific, 日本)。校對(duì)系數(shù)后,每個(gè)樣品取4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)在1.5mW,波長(zhǎng)532 nm的半導(dǎo)體激光下進(jìn)行分析?？臻g分辨率0.1 μm,積累時(shí)間60s,放大倍數(shù)50倍。每個(gè)試件取900 cm-1and 2400 cm-1范圍內(nèi)圖譜,以O(shè)rigin Pro 2018進(jìn)行相關(guān)分析。將未固化的粘接劑置于玻璃板上進(jìn)行光譜分析作為基數(shù)。雙鍵的聚合轉(zhuǎn)化率根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算：DC (%)=(1-［R 固化后/R 未固化］)×100%,R指脂肪族和芳香族在1637 cm-1處和1608 cm-1處波峰強(qiáng)度。

1.5.3 粘接強(qiáng)度 剩余27個(gè)牙根在根管上、下兩個(gè)部位以慢速切割機(jī)橫向截取1 mm左右厚度的牙片進(jìn)行粘接強(qiáng)度評(píng)價(jià)。每個(gè)水平各2片,分別進(jìn)行以下兩種處理：a. 即刻組：即刻測(cè)試粘接強(qiáng)度;b. 水解組：放置于0.1 mg/ml的膠原酶中72h后測(cè)試粘接強(qiáng)度。千分尺精確測(cè)量每個(gè)牙片的厚度和根管內(nèi)徑至0.01 mm。粘接面積由以下公式計(jì)算：A=π(R+r)√(R-r)2+h2。

π是常數(shù)3.14,R是上截面的內(nèi)半徑,r是下截面的內(nèi)半徑,h是試件的精確厚度。

將試件置于特制模具上通過(guò)萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)加載力（10 kg,1.0 mm/min）,計(jì)算各組粘接強(qiáng)度：P=N/A,

p是粘接強(qiáng)度MPa,N是脫粘接力N,A為粘接面積mm2

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS20.0（a=0.05）,聚合轉(zhuǎn)化率、粘接強(qiáng)度使用方差分析和SNK-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.結(jié)果

2.1 牙本質(zhì)表面SEM觀察 不同方式Csnp預(yù)處理后根管牙本質(zhì)內(nèi)壁表面見(jiàn)圖1。可見(jiàn)靜置方式下Csnp納米顆粒僅有少量聚集成團(tuán)的顆粒吸附在暴露的膠原纖維表面，大部分膠原纖維未見(jiàn)Csnp的吸附聯(lián)結(jié)（圖1-A）。超聲作用下，Csnp在根管內(nèi)壁表面分布較均勻，大部分暴露的膠原纖維網(wǎng)均可見(jiàn)納米顆粒的結(jié)合覆蓋，且較少出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象（圖1-B）。

圖1 .Csnp預(yù)處理后的根管內(nèi)壁

2.2 粘接界面電鏡觀察 電鏡觀察結(jié)果可見(jiàn)圖2。如圖所示：在各實(shí)驗(yàn)組中均可觀察到典型的混合層與樹(shù)脂突，也有部分試件的混合層可觀察到不連續(xù)、厚度不均一，甚至部分缺如，牙本質(zhì)/粘接劑界面可觀察到在樹(shù)脂突及混合層下出現(xiàn)間隙。Csnp預(yù)處理組個(gè)別試件可觀察到樹(shù)脂突與混合層中Csnp納米顆粒，其余實(shí)驗(yàn)組間未見(jiàn)明顯差異。

圖2 .粘接界面的電鏡觀察

2.3 粘接強(qiáng)度 各實(shí)驗(yàn)組的粘接強(qiáng)度可見(jiàn)表1。各實(shí)驗(yàn)組微推出粘接強(qiáng)度范圍從5.85-13.35Mpa。對(duì)照組在膠原降解后的粘接強(qiáng)度最低；Csnp預(yù)處理組的即刻粘接強(qiáng)度最高。就粘接方式而言，各組的即刻粘接強(qiáng)度沒(méi)有顯著差別（P=0.123），但膠原酶的降解使各實(shí)驗(yàn)組的粘接強(qiáng)度均有降低（P=0.001），其中對(duì)照組以51.1%的比例降低最多。A組和B組的降低分別為29.2%和34.1%。

表1 .各實(shí)驗(yàn)組微推出粘接強(qiáng)度（均數(shù)±SD)

2.4 聚合轉(zhuǎn)化率評(píng)價(jià) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組間的樹(shù)脂粘接劑的聚合轉(zhuǎn)化率沒(méi)有顯著差異（P=0.552），范圍為81.3%-83.3%。無(wú)論戊二醛還是Csnp、EDC的預(yù)處理，對(duì)于根管牙本質(zhì)的粘接劑的聚合固化，并沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。

表2 .各實(shí)驗(yàn)組的粘接界面的樹(shù)脂聚合轉(zhuǎn)化率（均數(shù)±SD)

3.討論

本研究的結(jié)果顯示Csnp 與交聯(lián)劑EDC 對(duì)根管內(nèi)壁的作用可以提高粘接界面的膠原纖維對(duì)酶解的抵抗性，穩(wěn)定粘接強(qiáng)度，且對(duì)粘接劑的聚合轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著影響。

前期研究中顯示：Csnp 與膠原纖維溶液的反應(yīng)是基于正負(fù)電荷的分子間相互吸引，形成一個(gè)典型聚合物[18]。但是，當(dāng)Csnp 溶液作用于脫礦牙本質(zhì)暴露的膠原纖維時(shí)，其相互之間的作用可能不完全相同。SEM（圖1）顯示Csnp 的作用方式對(duì)于其與脫礦牙本質(zhì)的膠原纖維的聯(lián)結(jié)具有影響。當(dāng)脫礦牙本質(zhì)在Csnp 溶液中靜置1 min 時(shí)電鏡顯示Csnp 納米粒子聚集成團(tuán)，稀疏的散落在牙本質(zhì)表面；而超聲作用1 min 使得Csnp 明顯密度增多，顆粒變小，較均勻的分散在脫礦牙本質(zhì)表面暴露的膠原纖維上。超聲因素在根管內(nèi)已被廣泛應(yīng)用于清理、殺菌、傳輸?shù)雀鱾€(gè)方面，而對(duì)于Csnp 納米顆粒在根管內(nèi)壁的分布與結(jié)合的影響，其原因可能在于超聲能量產(chǎn)生的聲流和輻射壓力可能有助于阻止納米顆粒的聚集結(jié)團(tuán)，并有助于顆粒對(duì)深層次的滲入，增加接觸頻率和時(shí)間，利于其在牙本質(zhì)表面更均一的分布。

Csnp 在牙本質(zhì)表面與膠原纖維的結(jié)合會(huì)給與纖維樁的粘接界面帶來(lái)以下方面影響。首先，前期的基礎(chǔ)研究表明，Csnp 可以與膠原纖維結(jié)合，并與膠原纖維酶反應(yīng)，降低纖維的降解[16]。在此基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為結(jié)合至牙本質(zhì)表面的Csnp 會(huì)降低粘接界面的纖維降解，穩(wěn)定粘接強(qiáng)度。粘接強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了這種想法。統(tǒng)計(jì)分析表明：交聯(lián)劑與Csnp的預(yù)處理對(duì)各試驗(yàn)組的即刻粘接強(qiáng)度并無(wú)顯著影響，但膠原酶作用72h 后，各組之間產(chǎn)生顯著差異，對(duì)照組降低量最多，明顯高于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明交聯(lián)劑或Csnp 對(duì)粘接界面的纖維起了保護(hù)的作用，降低其降解量，提高了纖維對(duì)膠原酶的抵抗，從而在膠原酶的作用下，其粘接強(qiáng)度降低量較少。而另一方面，在涂布粘接劑之前，粘接界面結(jié)合的Csnp對(duì)粘接劑固化是否影響，對(duì)粘接界在膠原纖維網(wǎng)的滲透是否影響，是需要評(píng)價(jià)的方面。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，各實(shí)驗(yàn)組的聚合轉(zhuǎn)化率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，反映Csnp 與交聯(lián)劑的預(yù)處理并沒(méi)有干擾到粘接層的固化，而粘接界面的SEM 照片顯示，各組均可觀察到樹(shù)脂滲透形成樹(shù)脂突，Csnp 組的部分試件可觀察到納米顆?；旌显谡辰咏缑婧蜆?shù)脂突中（見(jiàn)圖2），其余未見(jiàn)明顯組間差異。此外，各實(shí)驗(yàn)組的即刻粘接強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異，也從側(cè)面證明各實(shí)驗(yàn)組的牙本質(zhì)粘接面預(yù)處理（戊二醛，Csnp/EDC）并未對(duì)粘接劑固化和樹(shù)脂在管壁牙本質(zhì)的滲透產(chǎn)生影響。