姜黃素對(duì)高氧誘導(dǎo)的新生小鼠視網(wǎng)膜病變及notch 通路的影響

張艷莉，張彤

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變 （retinopathy of prematurity，ROP）又稱晶狀體后纖維增生癥，臨床上表現(xiàn)為新生血管生成、視網(wǎng)膜缺血、增生性視網(wǎng)膜病變，病情嚴(yán)重者可導(dǎo)致失明，隨著近幾年早產(chǎn)兒生存率增加，ROP 發(fā)病率也隨之增加，多發(fā)于低體重早產(chǎn)兒[1-2]。目前認(rèn)為視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常是ROP 的主要病因，因此緩解或阻止視網(wǎng)膜血管異常發(fā)育是當(dāng)前治療ROP 的熱點(diǎn)[3]。姜黃素（Curcumin）是姜黃的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)血脂等藥理作用[4-5]。最近研究表明，姜黃素可下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)水平，抑制血管生成和保護(hù)視網(wǎng)膜再灌注損傷[6-7]。Notch 信號(hào)通路作為生物體進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路，可調(diào)控下游基因介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤生成、胚胎發(fā)育等生理病理過程，幾乎涉及機(jī)體所有組織和器官[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)notch 信號(hào)通路可調(diào)控下游因子影響微血管穩(wěn)定性和血管生成[9]。姜黃素在ROP 中的應(yīng)用及如何調(diào)節(jié)notch 信號(hào)通路未見相關(guān)報(bào)道，因此本研究構(gòu)建高濃度氧（高氧）誘導(dǎo)的C57BL/6J 幼鼠視網(wǎng)膜病變（oxygen induced retinopathy，OIR）模型作為研究對(duì)象，檢測不同濃度姜黃素處理后OIR 病癥緩解情況，初步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2～3 周齡新生SPF 級(jí)C57BL/6J 健康幼鼠96只，購自成都達(dá)碩科技生物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2018-020，雌雄各半，未斷奶與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)。動(dòng)物房溫度設(shè)置為（25±1）℃，濕度（60±10）%，安靜無噪音，以12 h 為周期日光燈照明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由攝食、哺乳、飲水。

1.2 試劑與儀器

姜黃素（S31628，＞98%）購自上海源葉生物科技有限公司；阿帕替尼（MB3158，＞98%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；偶氮藍(lán)（EvanS 藍(lán)）（A865881，98%）上海麥克林生化科技有限公司；兔抗鼠notch、兔抗鼠VEGF、兔抗鼠內(nèi)參β-Actin、羊抗兔二抗購自美國Bioworld 公司；YKY-1200 型倒置二激發(fā)熒光顯微鏡購自上海永科光學(xué)儀器有限公司；Bio-Rad伯樂凝膠成像系統(tǒng)SYSTEM GelDoc XR+（1708195）購自美國BIO-RAD 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及造模

實(shí)驗(yàn)分組：（1）對(duì)照組（CG）,灌胃給藥0.2 mL 雙蒸水；（2）高氧模型組（HOG）；（3）低劑量姜黃素組（LCG），劑量為20 mg/kg；（4）中劑量姜黃素組（MCG），劑量為50 mg/kg；（5） 高劑量姜黃素組（HCG），劑量為100 mg/kg；（6）阿帕替尼組（APG），劑量為30 mg/kg[10]。每組16 只，各組幼鼠體重、雌雄差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），姜黃素用雙蒸水配制，灌胃給藥，給藥體積均為0.2 mL，每日1 次，給藥治療1 周[11]。

除對(duì)照組外，其余幼鼠建立高氧誘導(dǎo)模型：將出生1 周后的C57BL/6J 幼鼠與哺乳期母鼠在氧倉內(nèi)共同飼養(yǎng)，以1.5 L/min 的流量向氧倉通入100%濕潤醫(yī)用氧氣，控制氧氣濃度在（75±2）%。在造模期間，每隔4 h 檢測氧倉的濃度，以確保高氧環(huán)境，每天更換高氧環(huán)境中的哺乳期母鼠，同時(shí)觀察幼鼠的生理活動(dòng)情況，其余飼養(yǎng)方式按照常規(guī)方式進(jìn)行，幼鼠在高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d 后，回歸正常飼養(yǎng)環(huán)境，鼠齡為第17 d 時(shí)，采用眼底檢查法，檢查前30 min 先用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔，使用開瞼器將眼瞼分開，用前置鏡進(jìn)行眼底檢查，確認(rèn)模型均構(gòu)建成功。檢查2 h 后方可進(jìn)食，并按照分組給藥。

1.4 視網(wǎng)膜組織HE 染色

各組隨機(jī)選取8 只C57BL/6J 幼鼠脫頸處死，立刻摘取眼球，右眼球用于HE 染色；左眼球剝離視網(wǎng)膜組織，用于測定notch、VEGF 蛋白表達(dá)情況。

各組幼鼠右眼均在4℃條件下用4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，將石蠟包埋的切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位連續(xù)切片 （約6 μm），HE染色，每組隨機(jī)選取6 張切片，烘箱烘干，二甲苯脫臘10 min，將脫蠟后的切片依次用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水洗脫，然后脫水。蘇木素染色（5 min），鹽酸乙醇分化（30 s），50℃溫水浸泡5 min，然后脫水。伊紅染色（2 min），脫水、透明、中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)

將石蠟包埋的切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位連續(xù)切片（約6 μm），二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫行抗原修復(fù)，PBS 清洗3 次，置于3%過氧化氫溶液中，PBS 清洗3 次，3%BSA 覆蓋切片，滴加兔抗鼠VEGF（特異性標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞）一抗，孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色至棕黃色，蘇木素復(fù)染，乙醇（含1%鹽酸）分化，0.6%氨水反藍(lán)，乙醇脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察結(jié)果，每組取8 張切片，使用雙盲法統(tǒng)計(jì)每只眼球每張切片突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。注：（1）切片選取需避免視乳頭處；（2）僅計(jì)數(shù)與內(nèi)界膜有聯(lián)系的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。

1.6 偶氮藍(lán)灌注血管造影法視網(wǎng)膜鋪片

各組隨機(jī)選取8 只C57BL/6J 幼鼠，1%戊巴比妥鈉0.06 mL/g 腹腔麻醉后，將其固定在簡易手術(shù)臺(tái)上，沿前肢與下領(lǐng)連線的中點(diǎn)，打開皮膚，分離一側(cè)頸動(dòng)脈用，用無菌注射器抽取偶氮藍(lán)液體，針頭沿固定后的頸總動(dòng)脈血管走行刺入約3 mm，當(dāng)幼鼠嘴唇變藍(lán)后，取出針頭，夾閉頸總動(dòng)脈，脫頸處死幼鼠，立刻摘取眼球。使用多聚甲醛（4%）固定0.5 h 后取出，在顯微鏡下觀察，用虹膜剪沿角鞏膜緣剪開，去除晶體、玻璃體及角膜，沿角鞏膜邊緣將鞏膜壁剪一缺口（操作過程中勿碰觸視網(wǎng)膜），將視網(wǎng)膜剝離，剪成花瓣?duì)?，平鋪于無菌的載玻片上，封片，避光保存，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 各組視網(wǎng)膜notch、VEGF 蛋白表達(dá)水平測定

采用蛋白印跡法（western blotting，WB），將1.3中左眼視網(wǎng)膜組織加入含有蛋白酶抑制劑的200 μL裂解液，研磨至無組織碎塊，離心取上清。嚴(yán)格按照BCA 試劑盒說明書測定樣品總蛋白含量。加入樣品1/4 體積的5×上樣緩沖液，加熱至100℃，保持5 min。調(diào)整穩(wěn)壓電源至100 V，穩(wěn)壓電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，增大電壓至120 V，當(dāng)上樣緩沖液到達(dá)分離膠底部時(shí)，濕法轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉結(jié)合位點(diǎn)1 h。加入兔抗鼠notch（1:1000）、兔抗鼠VEGF（1:1000）、兔抗鼠內(nèi)參β-Actin（1:1000），4℃孵育過夜，用PBS 清洗3 次，加入羊抗兔二抗（1:1000），25℃孵育，PBS 清洗3 次，顯色劑顯色、曝光、凝膠成像設(shè)備觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）形式表示，多組比較行單因素方差分析，兩組均數(shù)相比行SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高氧誘導(dǎo)的新生幼鼠視網(wǎng)膜病模型的驗(yàn)證

正常環(huán)境飼養(yǎng)的C57BL/6J 幼鼠視網(wǎng)膜大血管管徑粗，分支清晰呈放射狀均勻分布，高氧誘導(dǎo)后，C57BL/6J 幼鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管出現(xiàn)內(nèi)皮增殖小結(jié)，血管呈小球狀，可見小出血及水腫，虹膜周邊有粘連，提示高氧誘導(dǎo)的新生幼鼠視網(wǎng)膜病模型構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 對(duì)照組和高氧模型組幼鼠眼底圖。1A 對(duì)照組（CG）；1B 高氧模型組（HOG），箭頭示血管呈小球狀，可見小出血及水腫

2.2 高氧誘導(dǎo)的新生幼鼠視網(wǎng)膜組織HE 染色

對(duì)照組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)均一，未見有明顯的血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜。HOG組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)不完整，有大量血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜。姜黃素給藥后，隨劑量增加，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)逐步恢復(fù)完整，突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)逐漸減少，HCG組OIR 癥狀明顯得到改善，緩解程度與APG組相當(dāng)（圖2）。

2.3 高氧誘導(dǎo)的新生幼鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)

突破視網(wǎng)膜界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)： 與CG組（1.20±0.26）個(gè)相比，HOG組（21.16±1.23）個(gè)，顯著增加（q=81.42，P=0.000）；與HOG組相比，LCG組（14.49±0.53）個(gè)、MCG組（10.14±0.62）個(gè)、HCG組（7.45±0.42）個(gè)依次減少（q=27.21、44.95、55.93，P 均=0.000）。APG組（7.09±0.68）個(gè)與HOG組相比顯著減少（q=57.39，P=0.000），與HCG組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.469，P=0.902）（圖3）。

圖2 高氧誘導(dǎo)的新生小鼠視網(wǎng)膜組織HE 染色（×200）。2A 對(duì)照組；2B 高氧模型組；2C 低劑量姜黃素組；2D 中劑量姜黃素組；2E 高劑量姜黃素組；2F 阿帕替尼組

圖3 視網(wǎng)膜組織VEGF 免疫組化染色（×100）。3A 對(duì)照組；3B 高氧模型組；3C 低劑量姜黃素組；3D 中劑量姜黃素組；3E 高劑量姜黃素組；3F 阿帕替尼組

2.4 偶氮藍(lán)灌注血管造影法視網(wǎng)膜鋪片

對(duì)照組可見視網(wǎng)膜血管自視盤發(fā)出的大血管向四周呈放射狀均勻分布，血管基本成熟，管徑粗，分支好，周邊血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清洗，管徑粗，分支好，走行規(guī)整。HOG 型組大血管明顯變細(xì)，分支減少，行走紊亂，視網(wǎng)膜遠(yuǎn)周及中央可見無灌注取，周邊血管密度增加，可見大量滲漏點(diǎn)，血管喪失放射狀結(jié)構(gòu)。姜黃素給藥后，隨劑量增加，視網(wǎng)膜大血管逐漸變粗，血管行走逐漸規(guī)整，分支增多，周邊網(wǎng)膜清晰，HCG組OIR 癥狀明顯得到改善，緩解程度與APG組相當(dāng)（圖4）。

2.5 高氧誘導(dǎo)的新生幼鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達(dá)水平

notch 蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比，HOG組notch蛋白表達(dá)水平顯著升高（q=28.01，P=0.000）；與HOG組相比，LCG組、MCG組、HCG組notch 蛋白表達(dá)水平依次下降 （qLCG=10.57，qMCG=17.69，qHCG=22.36，均P=0.000）。APG組notch 蛋白表達(dá)水平與HOG組相比顯著下降（q=22.61，P=0.000），與HCG 相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5 和表1）。

VEGF 蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比，HOG組VEGF蛋白表達(dá)水平顯著升高（q=25.68，P=0.000）；與HOG組相比，LCG組、MCG組、HCG組VEGF 蛋 白表達(dá)水平依次下降（qLCG=5.49，P=0.005；qMCG=14.27，P=0.000；qHCG=18.88，P=0.000）。APG組VEGF 蛋白表達(dá)水平與HOG組相比顯著下降 （q=19.10，P=0.000），與HCG組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）（圖5，表1）。

圖4 偶氮藍(lán)灌注血管造影法視網(wǎng)膜鋪片。4A 對(duì)照組；4B 高氧模型組；4C 低劑量姜黃素組；4D 中劑量姜黃素組；4E 高劑量姜黃素組；4F 阿帕替尼組

圖5 高氧誘導(dǎo)的新生小鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達(dá)水平。A 對(duì)照組；B 高氧模型組；C 低劑量姜黃素組；D 中劑量姜黃素組；E 高劑量姜黃素組；F 阿帕替尼組

表1 高氧誘導(dǎo)的新生小鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達(dá)水平（，n=8）

表1 高氧誘導(dǎo)的新生小鼠眼球組織中notch、VEGF蛋白表達(dá)水平（，n=8）

注：a 與HOG組相比，P＜0.05；b 與LCG組相比，P＜0.05；c 與MCG組相比，P＜0.05

3 討論

目前ROP 已成為早產(chǎn)兒失明的主要原因，占世界上兒童致盲病因的5%～20%[12]。ROP 發(fā)病機(jī)制分為高氧條件下血管關(guān)閉、消失和相對(duì)缺氧條件下血管異常增長。本研究選擇近交系的C57BL/6J 幼鼠，根據(jù)Smith 等[13]建立的方法構(gòu)建高氧誘導(dǎo)的新生小鼠視網(wǎng)膜病變模型。本研究采用眼底檢查法證明高氧誘導(dǎo)的C57BL/6J 新生小鼠OIR 模型構(gòu)建成功，與對(duì)照相比，高氧模型組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)不完整，有大量血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜，突破視網(wǎng)膜界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)顯著增加，大血管明顯變細(xì)，分支減少，行走紊亂，視網(wǎng)膜周邊及中央可見無灌注區(qū)，周邊血管密度增加，可見大量滲漏點(diǎn)，血管喪失放射狀結(jié)構(gòu)，說明高氧模型組新血管增生、形態(tài)異常，未形成正常的血管屏障，提示本研究成功構(gòu)建高氧誘導(dǎo)C57BL/6J 幼鼠視網(wǎng)膜病變模型。

姜黃素以藥理作用廣，副作用小成為目前研究的熱點(diǎn)之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠上調(diào)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Thy-1 表達(dá)水平，以緩解急性高眼壓家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷，提示姜黃素可能對(duì)視網(wǎng)膜具有一定的保護(hù)作用[15]。何瓊等[16]發(fā)現(xiàn)姜黃素治療糖尿病大鼠后視網(wǎng)膜病變較輕，Ets-1 表達(dá)水平下調(diào)，提示姜黃素可能抑制Ets-1 表達(dá)水平，從而緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變癥狀。隨后研究也證實(shí)姜黃素改善糖尿病引起的視網(wǎng)膜變薄、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)核層細(xì)胞凋亡、毛細(xì)血管基底膜增厚和光感受器細(xì)胞膜紊亂等癥狀[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與高氧模型組相比，低、中、高劑量姜黃素后，OIR 幼鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)逐步恢復(fù)完整，突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)減少，視網(wǎng)膜大血管變粗，血管行走規(guī)整，分支增多，周邊網(wǎng)膜清晰，呈劑量依賴性，且高劑量姜黃素與阿帕替尼藥效相近，說明經(jīng)治療后，OIR 幼鼠視網(wǎng)膜病變癥狀得到緩解，血管生長趨向正常，提示姜黃素能夠緩解OIR 幼鼠視網(wǎng)膜病變癥狀，有望成為治療ROP 的備選藥物。

隨著新生兒血管發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜血管發(fā)育不完整，導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血，進(jìn)一步引起新生血管形成且伴有纖維化，致使視網(wǎng)膜病變、脫離，因此從血管生成抑制方面研究如何預(yù)防或治療ROP 意義深遠(yuǎn)。VEGF 在糖尿病視網(wǎng)膜患者血清中高表達(dá)，說明VEGF 與血管內(nèi)皮功能、微血管損傷相關(guān)[18]。黃黎黎等[19]研究表明拮抗VEGF 治療能夠改善視網(wǎng)膜微血管功能和黃斑水腫，增強(qiáng)激光療效。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高氧模型組視網(wǎng)膜組織中VEGF 表達(dá)水平顯著升高，提示幼鼠OIR 進(jìn)程中VEGF 高表達(dá)。與高氧模型組相比，低、中、高劑量姜黃素組視網(wǎng)膜組織中VEGF 蛋白表達(dá)水平顯著下降，呈劑量依賴性，且高劑量姜黃素與阿帕替尼作用一致，提示姜黃素可抑制OIR 幼鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF 表達(dá)，從而緩解幼鼠OIR 癥狀，但是姜黃素通過何種通路下調(diào)VEGF 表達(dá)水平還有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過阻斷Notch 信號(hào)通路，抑制NF-kB 的表達(dá)，下調(diào)腫瘤組織中VEGF 表達(dá)水平，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長[20]。賀桂芳等[21]研究表明姜黃素PDT 可有效阻斷Notch 信號(hào)通路，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。本研究表明，與對(duì)照組相比，高氧模型組視網(wǎng)膜組織中notch 表達(dá)水平顯著升高，提示notch 信號(hào)通路可能參與幼鼠OIR。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與高氧模型組相比，低、中、高劑量姜黃素組、阿帕替尼組視網(wǎng)膜組織中notch 表達(dá)水平顯著下降，呈劑量依賴性，高劑量姜黃素組與阿帕替尼組相比無差異，提示姜黃素能夠下調(diào)notch 表達(dá)水平，可能通過阻斷notch 信號(hào)通路而緩解幼鼠OIR 癥狀。

綜上所述，姜黃素可能通過阻斷notch 信號(hào)通路，抑制VEGF 表達(dá)，減少血管異常增生，進(jìn)而緩解幼鼠OIR 癥狀，推測姜黃素有望成為臨床上治療ROP 的備選藥。但由于本研究小鼠模型實(shí)驗(yàn)樣本量小，且不能完全代表早產(chǎn)兒ROP 的發(fā)病過程，該研究結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和從細(xì)胞水平研究加以驗(yàn)證。