魚藤素對急性髓系白血病KG-1a細胞增殖和凋亡的影響及機制

趙小強，吳雅莉，仝佳音，席曉平，程英英，楊海平

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院/河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院血液內(nèi)科，河南 洛陽 471000)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是造血干細胞發(fā)生異常增殖的一種惡性疾病，病死率較高[1]。隨著多藥聯(lián)合化學(xué)治療、免疫治療、造血干細胞移植等的應(yīng)用，AML的預(yù)后得以改善，但化學(xué)治療毒副作用大、完全緩解率低、易復(fù)發(fā)且易發(fā)展為難治性白血?。幻庖咧委熗ㄟ^人為增強或抑制機體的免疫功能以達到治療疾病目的，容易影響自身免疫系統(tǒng)；造血干細胞移植可根治該病，但來源不足[2-3]。魚藤素是從一種自豆科植物絹毛萌豆中分離的擬魚藤酮類化合物，具有抗病毒、抗腫瘤等藥理作用，已被證實對肝癌、乳腺癌細胞有增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，且可增強腫瘤細胞對放射治療和化學(xué)治療的敏感性[4-5]。但目前關(guān)于魚藤素對AML治療作用及相關(guān)機制的研究尚少[6-7]。因此， 本研究旨在探討魚藤素對AML KG-1a細胞增殖、凋亡的影響及機制，以期為AML的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器AML KG-1a細胞購自上海名勁生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京諾為生物技術(shù)有限公司，胰蛋白酶購自深圳樂芙生物科技有限公司，魚藤素購自湖州展舒生物科技有限公司，氯化鋰(lithium chloride，LiCl)購自江西贛鋒鋰業(yè)股份有限公司，二甲基噻唑(dimethylthiazole，MTT)溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液購自上海士鋒生物科技有限公司，Annexin V binding buffer標(biāo)記液、Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒、SYBR Green Mix、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Sigma公司，放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation,RIPA)裂解液購自西安赫特生物科技有限公司，兔抗人S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2)一抗、β-鏈接素(β-catenin)一抗、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]一抗、山羊抗兔IgG二抗購自美國Sigma公司，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)顯色液購自上海西唐生物科技有限公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社，Tecan-5082 Sunrise型全自動酶標(biāo)儀購自奧地利TECAN公司，Amnis ImageStream X MK Ⅱ型流式細胞儀購自德國Luminex公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組將KG-1a細胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至密度75%時，用胰蛋白酶消化并傳代，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期KG-1a細胞，胰蛋白酶消化后以每孔1×108L-1個細胞接種于6孔板，隨機分為0.00 nmol·L-1魚藤素組、10.00 nmol·L-1魚藤素組、20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組，分別用含有0.00、10.00、20.00、40.00、80.00 nmol·L-1魚藤素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)5個復(fù)孔。

另取對數(shù)生長期KG-1a細胞，胰蛋白酶消化后以每孔2×105個細胞接種于6孔板，隨機分為空白組、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組?？瞻捉M細胞用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，魚藤素組細胞用含80.00 nmol·L-1魚藤素的培養(yǎng)基培養(yǎng) 72 h，LiCl組細胞用含30 mmol·L-1LiCl的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，魚藤素+LiCl組細胞用含80.00 nmol·L-1魚藤素和30 mmol·L-1LiCl的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察0.00 nmol·L-1魚藤素組、10.00 nmol·L-1魚藤素組、20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞干預(yù)48 h的生長狀態(tài)。

1.2.3 MTT實驗檢測細胞增殖能力0.00 nmol·L-1魚藤素組、10.00 nmol·L-1魚藤素組、20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞干預(yù)24、48、72 h后，每孔加入20 μL新鮮制備的MTT溶液(5.00 g·L-1)，4 h后離心棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，振蕩10 min，觀察到甲瓚顆粒完全溶解后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定波長570 nm處吸光度值，吸光度值越大表示細胞增殖能力越強。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況取空白組、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞，用胰蛋白酶消化并收集細胞至離心管中，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌，Annexin V binding buffer標(biāo)記液沖洗后離心，棄上清，200 μL Annexin V binding buffer標(biāo)記液重懸，加入5 μL AnnexinV- FITC混合均勻，4 ℃避光孵育15 min，加入5 μL PI染液混合均勻，避光反應(yīng)30 min，應(yīng)用流式細胞儀上樣并檢測各組細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布取空白組、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞，用胰蛋白酶消化并收集細胞至離心管中，4 ℃ 、1 800 r·min-1離心10 min(離心半徑12 cm)，使用預(yù)冷PBS沖洗細胞后4 ℃ 、1 800 r·min-1離心10 min，預(yù)冷PBS重懸細胞，加入預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)70%乙醇混勻，4 ℃固定12 h，4 ℃ 、1 800 r·min-1離心10 min，預(yù)冷PBS沖洗細胞，加入RNA酶A(RNaseA)使其終質(zhì)量濃度為25 mg·L-1，37 ℃水浴30 min，加入PI染液使其終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，4 ℃避光染色30 min，使用300目尼龍網(wǎng)過濾。使用流式細胞儀上樣并檢測細胞周期。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 qRT-PCR法檢測細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA表達取空白組、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞，用胰蛋白酶消化并收集細胞至離心管中，采用TRIzol試劑盒提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR法檢測SKP2、β-catenin、PARP mRNA表達。SKP2上游引物序列為5′-GTCTGCACCATGCGCAATGCGTCA-3′，下游引物序列為5′-CTACGCGTGCACACGCTGCACCGC-3′；β-catenin上游引物序列為5′-ACGTGCACGCGTGCAAGGGCCTGC-3′， 下游引物序列為5′-CATGTGTACGTCCACGGTTGCGTA-3′；PARP上游引物序列為5′-TGGCACGTGCAGCTAGTCACGTGC-3′， 下游引物序列為5′-GTGCGCTCTGTGTCGTGTCACGTG-3′；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列為5′-CTTTGCACCGCACGTGCGCATTAG-3′ ， 下游引物序列為5′-GTGCACGCTGCACGCTGTCAATGC-3′。 反應(yīng)體系為SYBR Green Mix 11 μL，cDNA模板1.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加入雙蒸水至總反應(yīng)體系為20.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃變性35 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 40個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。采用2-△△Ct法計算SKP2、β-catenin、PARP mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.7 Western blot法檢測細胞中SKP2、β-catenin、PARP蛋白表達取空白組、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞，用胰蛋白酶消化并收集細胞至離心管中，預(yù)冷PBS洗滌，加入100 μL預(yù)冷RIPA裂解液裂解，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣本，沸水煮10 min使其變性，使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白恒壓轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，Tris緩沖生理鹽水洗滌；加入兔抗人SKP2、β-catenin、PARP一抗(稀釋度均為11 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋度均為12 000)，常溫孵育2 h，Tris緩沖生理鹽水洗滌；滴加ECL顯色劑，暗室中曝光、顯影，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，以SKP2、β-catenin、PARP蛋白條帶灰度值與GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 5組細胞形態(tài)學(xué)變化結(jié)果見圖1。魚藤素干預(yù)48 h時，與0.00 nmol·L-1魚藤素組比較，10.00 nmol·L-1魚藤素組、20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞間隙增大，細胞數(shù)量顯著減少，形態(tài)不規(guī)則，細胞核固縮、碎片增加，且隨著魚藤素藥物干預(yù)濃度的增加，細胞數(shù)量逐漸減少，形態(tài)變化逐漸明顯。

A:0.00 nmol·L-1魚藤素組;B:10.00 nmol·L-1魚藤素組;C:20.00 nmol·L-1魚藤素組;D:40.00 nmol·L-1魚藤素組;E:80.00 nmol·L-1魚藤素組。

2.2 5組細胞增殖能力比較結(jié)果見表1。魚藤素干預(yù)24、48、72 h時，10.00 nmol·L-1魚藤素組、20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于0.00 nmol·L-1魚藤素組，20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于10.00 nmol·L-1魚藤素組，40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于20.00 nmol·L-1魚藤素組，80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于40.00 nmol·L-1魚藤素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素干預(yù)24、48、72 h時，5組細胞的增殖能力隨培養(yǎng)時間延長而降低，組內(nèi)各時間點之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 5組細胞增殖能力比較

2.3 4組細胞凋亡率比較結(jié)果見圖2?？瞻捉M、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞凋亡率分別為(5.37±0.61)%、(34.89±4.57)%、(2.54±0.36)%、(21.10±4.69)%?？瞻捉M、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=104.037，P<0.05)?？瞻捉M、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞凋亡率均顯著低于魚藤素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。空白組、LiCl組細胞凋亡率均顯著低于魚藤素+LiCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LiCl組細胞凋亡率顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A:空白組;B:魚藤素組;C:LiCl組;D:魚藤素+LiCl組。

2.4 4組細胞周期分布比較結(jié)果見表2和圖3?？瞻捉M、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組G0/G1、G2/M細胞占比比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.150，P<0.05)?？瞻捉M、魚藤素+LiCl組、魚藤素組的G0/G1細胞占比顯著低于LiCl組，G2/M細胞占比顯著高于LiCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素+LiCl組、魚藤素組的G0/G1細胞占比顯著低于空白組，G2/M細胞占比顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素組的G0/G1細胞占比顯著低于魚藤素+LiCl組，G2/M細胞占比顯著高于魚藤素+LiCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4組S期細胞占比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.696，P>0.05)。

表 2 4組細胞周期分布比較

2.5 4組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA相對表達量比較結(jié)果見表3?？瞻捉M、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=77.343、77.343、44.555，P<0.05)?？瞻捉M、魚藤素+LiCl組、魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA相對表達量顯著低于LiCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素+LiCl組、魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA相對表達量顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA相對表達量顯著低于魚藤素+LiCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 4組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA相對表達量比較

2.6 4組細胞中SKP2、β-catenin、PARP蛋白相對表達量比較結(jié)果見表4和圖4?？瞻捉M、魚藤素組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞中SKP2、β-catenin、PARP 蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=98.313、102.853、114.515，P<0.05)?？瞻捉M、魚藤素+LiCl組、魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP 蛋白相對表達量顯著低于LiCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素+LiCl組、魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP 蛋白相對表達量顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP 蛋白相對表達量顯著低于魚藤素+LiCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 4組細胞中SKP2、β-catenin、PARP蛋白相對表達量比較

1:空白組;2:魚藤素組;3:LiCl組;4:魚藤素+LiCl組。

3 討論

AML屬于惡性克隆性疾病，源自淋巴源性多潛能祖細胞或髓系祖細胞，細胞克隆中的白血病干細胞發(fā)生失控性增生、分化障礙，大量累積在外周血、骨髓及其他造血組織中，并對其他器官與組織造成浸潤，抑制正常造血系統(tǒng)，導(dǎo)致器官浸潤、感染、貧血、出血等癥狀[8-9]。盡管白血病干細胞與正常干細胞均具有自我更新及分化潛能，但白血病干細胞自我調(diào)控能力喪失，并抵抗常規(guī)放射治療和化學(xué)治療，是AML復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的種子細胞[10]。因此，探尋白血病干細胞靶向治療方式，抑制其不可控性增殖，同時誘導(dǎo)其凋亡，為治愈AML提供了新的希望。

有研究顯示，AML實質(zhì)上是一類細胞周期性疾病，其發(fā)生、發(fā)展與細胞周期關(guān)系密切，臨床上常用的AML化學(xué)治療藥物基本上是通過影響DNA的合成進而阻滯細胞周期來達到抑制白血病干細胞生長的目的[11]。魚藤素是一種異黃酮類化合物，近年來有研究表明，魚藤素對細胞增殖、生長、細胞周期分布、凋亡等具有調(diào)節(jié)作用，可抑制血管新生，以癌變細胞及癌變前細胞為攻擊目標(biāo)，通過介導(dǎo)相關(guān)特定分子代謝途徑阻斷其生長，從而發(fā)揮強大的抗癌活性[12-13]。此外，魚藤素作為天然植物提取物在起到抗腫瘤作用的同時對病灶周邊組織的正常細胞影響較小，安全性高，具有廣闊的應(yīng)用前景。ZHANG等[14]研究表明，無論是體內(nèi)實驗還是體外實驗，魚藤素均表現(xiàn)出誘導(dǎo)AML細胞分化的效果，認(rèn)為魚藤素具有AML治療作用。本研究結(jié)果顯示，魚藤素干預(yù)24、48、72 h后，10.00 nmol·L-1魚藤素組、20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于0.00 nmol·L-1魚藤素組，20.00 nmol·L-1魚藤素組、40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于10.00 nmol·L-1魚藤素組， 40.00 nmol·L-1魚藤素組、80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于20.00 nmol·L-1魚藤素組，80.00 nmol·L-1魚藤素組細胞增殖能力顯著低于40.00 nmol·L-1魚藤素組；且魚藤素組凋亡率、G2/M細胞占比顯著高于空白組，提示魚藤素對AML細胞具有增殖抑制、促進凋亡及細胞周期阻滯作用，且表現(xiàn)為劑量依賴性。

Wnt信號通路是重要的細胞增殖、分化調(diào)控途徑，參與細胞極化、黏附、遷移等行為，且與其他信號通路具有交叉、協(xié)同作用，調(diào)控祖細胞及干細胞增殖、分化。β-catenin是Wnt信號通路的重要因子，且是將AML細胞生物信號自細胞膜轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)的信使。Wnt信號通路被激活后，β-catenin可在細胞內(nèi)大量累積，并參與細胞連接位置黏合帶的形成。此外，游離性β-catenin可進入細胞核參與SKP2、PARP等下游基因表達的調(diào)控。KANG等[15]研究顯示，Wnt信號通路的失控將觸發(fā)骨髓造血干細胞髓樣再生，并損害下游多能祖細胞的產(chǎn)生及血液輸出，從而參與AML發(fā)生及發(fā)展。YUAN等[16]研究發(fā)現(xiàn)，激活Wnt/β-catenin信號通路將進一步增強AML細胞惡性程度，提示該通路在AML發(fā)病機制中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組、LiCl組、魚藤素+LiCl組細胞凋亡率均顯著低于魚藤素組，空白組、LiCl組細胞凋亡率均顯著低于魚藤素+LiCl組，LiCl組細胞凋亡率均顯著低于空白組；空白組、魚藤素+LiCl組、魚藤素組G0/G1細胞占比顯著低于LiCl組，G2/M細胞占比顯著高于LiCl組；魚藤素+LiCl組、魚藤素組G0/G1細胞占比顯著低于空白組，G2/M細胞占比顯著高于空白組；魚藤素組G0/G1細胞占比顯著低于魚藤素+LiCl組，G2/M細胞占比顯著高于魚藤素+LiCl組；提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路激活劑LiCl干預(yù)KG-1a細胞后，魚藤素凋亡抑制及細胞阻滯作用被削弱，說明魚藤素通過抑制激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮對AML細胞的凋亡抑制及細胞阻滯作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組、魚藤素+LiCl組、魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA及蛋白相對表達量顯著低于LiCl組，魚藤素+LiCl組、魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA及蛋白相對表達量顯著低于空白組，魚藤素組細胞中SKP2、β-catenin、PARP mRNA及蛋白相對表達量顯著低于魚藤素+LiCl組，提示魚藤素可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)下游基因SKP2、β-catenin、PARP影響AML細胞的增殖及凋亡。

綜上所述，魚藤素對AML KG-1a細胞具有增殖抑制、細胞周期阻滯及促進凋亡作用，其機制可能與抑制SKP2、β-catenin、PARP表達有關(guān)。