蒙古扁桃石油醚提取物對博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的治療作用*

王艷國，周紅兵，郝海梅，吳 桐，常 虹，石松利,2

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院蒙中藥活性物質(zhì)與功能研究所)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis)亦稱間質(zhì)性肺病，是由多種彌慢性肺間質(zhì)疾病引起的病理改變，亦是對肺損傷過度修復(fù)的結(jié)果，晚期多引起心、肺功能衰竭以及呼吸衰竭而導(dǎo)致死亡，成為呼吸系統(tǒng)的難治疾病，嚴(yán)重危害人類健康[1]。近年來，隨著空氣污染以及不良生活習(xí)慣的影響，肺纖維化發(fā)病率逐年遞增，但尚無理想藥物和治療方法，為此尋找能夠治療肺纖維化的藥物具有十分重要的意義。

蒙古扁桃(Amygdalus mongolica)，蒙名烏蘭-布衣勒斯，為蒙古高原特有的阿拉善荒漠種，薔薇科扁桃屬旱生落葉灌木[2-3]。作為一種傳統(tǒng)中蒙藥可代“郁李仁”以種仁入藥，具有治療咽喉干燥、干咳及支氣管炎的作用[4-5]。課題組鄭倩男等[6-8]前期研究表明蒙古扁桃石油醚提取物能有效調(diào)節(jié)血脂水平，具有抗氧化和保肝的作用。吳桐等[9-10]研究表明蒙古扁桃石油醚提取物對治療四氯化碳所導(dǎo)致的大鼠肝纖維化效果較好。賈小葉等[11]研究表明蒙古扁桃藥材石油醚部位可以發(fā)揮抗大鼠腎纖維化的作用。同時有研究表明中醫(yī)藥對肺纖維化有較好的治療效果[12]。因此基于蒙古扁桃的傳統(tǒng)藥理作用，本實驗在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，利用博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，探討蒙古扁桃石油醚提取物對博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的治療作用。

1 對象與方法

1.1藥物與動物 蒙古扁桃，采自阿拉善雅布來戈壁，經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院石松利教授鑒定為蒙古扁桃藥材干燥成熟種子；注射用鹽酸博來霉素(批號：540402)，購自日本化藥株式會社；醋酸潑尼松片(批號：140905)，購自浙江仙琚制藥股份有限公司；60只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實驗動物科學(xué)部)，許可證號SCXK(京)2011-0012。于室溫(25±2)℃，相對濕度(50±5)%條件下飼養(yǎng)。

1.2試劑與儀器 MDA試劑盒(批號：20150421)、SOD試劑盒(批號：20150505)、HYP試劑盒(批號：20150527)、總蛋白定量測定試劑盒(批號：20150519)，均購自南京建成生物工程研究所；DZW-8-8型水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；MH-250型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；CX31顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1蒙古扁桃石油醚提取物的制備 蒙古扁桃種子去殼洗凈后攪碎成顆粒，在料液比1∶10的條件下運用索氏提取法，分別采用95 %、50 %乙醇水浴回流，得到粗提液后回收溶劑，使藥液呈浸膏狀。將浸膏以石油醚為溶劑萃取，并減壓濃縮萃取物，即得蒙古扁桃石油醚提取物，得率為13.7 %。按給藥組高、中、低劑量1.75 g/kg、1.25 g/kg、0.75 g/kg，用0.5 %羧甲基纖維素鈉將蒙古扁桃石油醚提取物配制成濃度為0.024 g/mL的溶液。大鼠高、中、低劑量組給藥劑量分別為10 mL/kg、7.14 mL/kg、4.28 mL/kg，所有灌胃藥液均置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2動物分組與用藥 60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)至體重為(300±20)g時，按體重隨機分為對照組、模型組、陽性藥強的松組、蒙古扁桃石油醚提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。

1.3.3實驗動物模型建立 用1 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于實驗臺，開口器固定口腔，拉出舌，用壓舌板壓舌腹，在額鏡直視下，趁動物吸氣瞬間迅速進行氣管插管(52 mm,4～5 cm)，動物模型組大鼠按5 mL/kg緩慢注入1 mg/mL的博來霉素，之后立即旋轉(zhuǎn)搖晃大鼠，使藥液在肺內(nèi)均勻分布[13-14]。各組于造模24 h后灌胃給藥，1次/d，連續(xù)灌胃4周。

1.3.4標(biāo)本采集 于造模后第28 d處死大鼠，用10 %水合氯醛根據(jù)大鼠體重進行腹腔注射麻醉后，使其處于仰臥位，打開腹腔，取腹主動脈血以及肺、心組織并稱重(測定肺、心臟器系數(shù))；將肺組織切塊分裝，用液氮速凍后于-80℃冰箱中保存(后期進行HE、Masson染色及測定組織HYP)。采集腹主動脈血于4 ℃、以6 000轉(zhuǎn)/min冷凍離心10 min，分離血清，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存(檢測血清SOD、MDA)。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般狀況 對照組大鼠活潑好動，食量大，體型肥碩，皮毛光澤，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)；模型組精神不振，行動遲緩，拱背蜷縮，皮毛枯槁、無光澤，身體較其它組消瘦，呼吸急促、有咳喘現(xiàn)象。蒙古扁桃石油醚提取物不同劑量組和陽性藥強的松組灌胃治療1周后大鼠狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，食量增大，體重逐漸增加且拱背蜷縮減輕。

2.2蒙古扁桃石油醚提取物對肺纖維化大鼠肺、心系數(shù)的影響 如圖1所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺、心系數(shù)升高(P<0.05)；與模型組相比，蒙古扁桃石油醚提取物低劑量組大鼠肺系數(shù)降低，高、低劑量組與陽性藥組均能降低大鼠心系數(shù)(P<0.05)。

2.3蒙古扁桃石油醚提取物對肺纖維化大鼠肺病理組織學(xué)的影響

2.3.1大鼠肺組織HE染色 結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠肺組織肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔未見增厚；模型組大鼠肺組織肺泡間隔明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)消失，廣泛的纖維灶形成；蒙古扁桃各給藥組與陽性藥組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺纖維化程度較模型組減輕，見圖2。

2.3.2Masson染色 鏡下觀察所見假手術(shù)組為正常肺組織結(jié)構(gòu)，僅小部分肺泡周圍或支氣管壁輕微增厚；模型組肺組織可見全視野纖維化改變；蒙古扁桃各給藥組肺泡或支氣管壁中度增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，有小范圍纖維灶形成，肺纖維化程度較模型組減輕，見圖3。

2.4蒙古扁桃石油醚提取物對肺纖維化大鼠肺組織中HYP的影響 如圖4所示，與假手術(shù)組相比，模型組肺組織HYP含量增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，蒙古扁桃石油醚提取物高、低劑量組能降低肺組織HYP含量(P<0.05)。

2.5蒙古扁桃石油醚提取物對肺纖維化大鼠血清SOD，MDA的影響 如圖5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的血清SOD下降，MDA增高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，蒙古扁桃石油醚提取物高、中、低劑量組與陽性藥組均能提高血清SOD，降低血清MDA含量(P<0.05)。

3 討論

一次性氣管內(nèi)灌注博來霉素誘導(dǎo)的動物肺纖維化模型是目前國內(nèi)外常用、受認可的肺纖維化造模方法[15]。本實驗利用該模型探究蒙古扁桃石油醚提取物對肺纖維化這一具體病理改變的治療作用。課題組前期實驗中對蒙古扁桃石油醚提取物降血脂作用進行了量效關(guān)系確定，設(shè)置生藥量為0.1875 g/kg、0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg、3.0 g/kg的不同實驗劑量組，結(jié)果顯示其降血脂作用的有效劑量范圍是(0.5～1.5)g/kg。進一步實驗表明，蒙古扁桃石油醚提取物在生藥量(0.75～1.5)g/kg對肝纖維化大鼠肝臟具有一定保護作用，依據(jù)器官纖維化異病同治的研究思路，本次實驗選取0.75 g/kg、1.25 g/kg、1.75 g/kg的生藥劑量[9]。

肺系數(shù)是反應(yīng)肺纖維化程度的指標(biāo)之一，其高低與肺重量和體重密切相關(guān)，其中肺重量增加是肺系數(shù)增大的主要原因。長期肺纖維化改變會引起呼吸衰竭，導(dǎo)致一定程度的血氧分壓下降和二氧化碳分壓上升，從而引起反射性心率加快、心肌收縮能力增強及心排出量增加，最終導(dǎo)致心臟增大，從而心系數(shù)增大。本研究結(jié)果顯示蒙古扁桃石油醚提取物低劑量組能降低大鼠肺、心系數(shù)；高劑量組能降低大鼠心系數(shù)，說明蒙古扁桃石油醚提取物具有一定的對抗博萊霉素致大鼠肺損傷的作用。HYP是膠原蛋白的組成成分，約占其氨基酸總量的13.4 %，通過對肺組織中HYP含量的測定可以了解其膠原蛋白分解代謝情況，其含量可間接反映組織纖維化程度[16]。SOD可抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化，其活力的高低對機體清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化能力有著間接反應(yīng)[17]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低體現(xiàn)機體脂質(zhì)過氧化程度[18]。研究結(jié)果表明，蒙古扁桃石油醚提取物低劑量組可降低血清MDA以及肺組織HYP水平，提高血清SOD含量；蒙古扁桃石油醚提取物中劑量組可降低大鼠血清MDA含量，提高血清SOD含量；蒙古扁桃石油醚提取物高劑量組可降低大鼠血清MDA及肺組織HYP水平，提高血清SOD含量。提示蒙古扁桃石油醚提取物具有清除活性氧，提高機體抗氧化能力以及抗脂質(zhì)過氧化的作用，從而達到抗肺纖維化的目的。

綜上所述，蒙古扁桃石油醚提取物具有較好的抗肺纖維化作用，實驗結(jié)果為蒙古扁桃藥用價值的進一步開發(fā)與利用提供了一定的實驗基礎(chǔ)與研究依據(jù)。