基于生物信息學(xué)分析白血病抑制因子受體與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)關(guān)系

田甜， 鄧飛， 唐金海

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)是一種具有廣泛活性的細(xì)胞因子。白血病因子抑制受體(leukemia inhibitory factor receptor，LIFR)又稱CD118，它與糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)的跨膜和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域密切相關(guān)，并可以通過與gp130形成復(fù)合物以激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(the janus kinase/signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol kinase 3-kinase,PI3Ks)信號通路[1-4]。其中JAK/STAT信號通路是多種細(xì)胞因子的共同傳導(dǎo)途徑，一旦激活，JAK就會使STAT磷酸化，當(dāng)STAT的第705個(gè)酪氨酸(Tyr)被磷酸化后，STAT可以形成二聚體入核，進(jìn)一步結(jié)合輔助因子和協(xié)助轉(zhuǎn)錄因子啟動轉(zhuǎn)錄。JAK/STAT信號傳導(dǎo)途徑也是激活炎性反應(yīng)的上游信號傳導(dǎo)，被認(rèn)為是炎性疾病的治療目標(biāo)[5-8]。同樣的，JAK還可以激活含SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白磷酸酶2(SHP2)或PIK3通過MAPK或PI3K-AKT信號通路參與炎性反應(yīng)[9]。研究結(jié)果表明，LIFR/STAT3信號傳導(dǎo)可以賦予擴(kuò)散至骨髓的乳腺癌細(xì)胞休眠表型，且該途徑的失活可以原本處于休眠狀態(tài)的乳腺癌細(xì)胞下調(diào)休眠、靜止?fàn)顟B(tài)，而缺氧可以下調(diào)乳腺癌中LIFR的表達(dá)水平[10]。一項(xiàng)在印度的調(diào)查研究顯示，乳腺癌中普遍存在LIFR表達(dá)缺失現(xiàn)象，76.64%的乳腺癌病例中出現(xiàn)了LIFR啟動子的甲基化，且LIFR啟動子甲基化與LIFR的蛋白表達(dá)水平下降相關(guān)[11]。LIFR還可以在MCF7細(xì)胞中充當(dāng)腫瘤抑制因子，在SUM159人乳腺癌細(xì)胞中作為乳腺癌肺轉(zhuǎn)移抑制因子[12-13]。本研究通過生物信息學(xué)，分析LIFR在不同癌癥類型中的表達(dá)，并進(jìn)一步驗(yàn)證LIFR與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 LIFR表達(dá)水平分析 使用Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)[14-15]分析LIFR在多種癌癥類型中癌組織和正常組織中的mRNA表達(dá)水平。TIMER(tumor immune estimation resource，cistrome.shinyapps.io/timer)是一個(gè)可以全面系統(tǒng)分析腫瘤與免疫相互作用的數(shù)據(jù)庫，它提供了包括基因表達(dá)、臨床結(jié)果、體細(xì)胞突變和體細(xì)胞拷貝數(shù)變化的在線分析[16-17]，再通過TIMER數(shù)據(jù)庫Diff Exp模塊分析LIFR在不同癌癥類型中癌組織與正常組織的mRNA表達(dá)水平。

1.2 腫瘤突變負(fù)荷與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)性分析UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)[18]下載TCGA數(shù)據(jù)庫中33種癌癥類型的突變數(shù)據(jù)，利用perl腳本根據(jù)腫瘤突變負(fù)荷定義計(jì)算每兆堿基中有多少個(gè)堿基發(fā)生了突變，即為每個(gè)樣品的TMB值。通過spearman檢驗(yàn)計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷與LIFR基因表達(dá)相關(guān)性。同樣通過spearman方法計(jì)算微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與LIFR基因表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果以R“fmsb”包繪制雷達(dá)圖表示(***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

1.3 LIFR與乳腺癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)性分析 利用“ESTIMATE”R包計(jì)算乳腺癌各個(gè)樣品的免疫打分和基質(zhì)打分，將得到的腫瘤微環(huán)境打分文件與基因表達(dá)文件取交集，通過計(jì)算spearman相關(guān)系數(shù)，以P<0.001為過濾標(biāo)準(zhǔn)將符合標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果利用“ggplot2”、“ggpubr”和“ggExtra”R包進(jìn)行可視化。

1.4 LIFR對乳腺癌的預(yù)后分析 使用PrognoScan(http://www.abren.net/PrognoScan/)[19]評估LIFR對預(yù)后的影響，PrognoScan結(jié)果顯示LIFR表達(dá)高低與患者預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系，如總生存期(overall survival, OS)、疾病特異性生存期(disease free survival，DSS)、無復(fù)發(fā)生存期(relapse free survival，RFS)和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期(distant metastasis free survival，DMFS)。閾值設(shè)定為Cox P<0.05。Kaplan Meierplotter數(shù)據(jù)庫能夠評估21種癌癥類型的54k基因?qū)︻A(yù)后的影響。Kaplan Meierplotter中的數(shù)據(jù)集包括乳腺癌(n=6 234)，卵巢癌(n=2 190)，肺癌(n=3 452)和胃癌(n=1 440)。通過Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis)[20]分析乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌中LIFR的表達(dá)與生存的相關(guān)性。

1.5 TISIDB數(shù)據(jù)庫分析LIFR在乳腺癌免疫亞型、分子亞型中的分布情況 通過TISIDB數(shù)據(jù)庫(http://cis.hku.hk/TISIDB/)[21]亞型模塊分析LIFR在乳腺癌免疫亞型、分子亞型中的分布情況，結(jié)果以小提琴圖表示。

1.6 乳腺癌中LIFR啟動子甲基化水平分析 為進(jìn)一步分析LIFR在乳腺癌中下調(diào)的可能原因，我們通過UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)進(jìn)行分析。UALCAN可以方便地訪問公開的癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)(包括TCGA和MET500)，可以通過啟動子甲基化評估基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控[22]。UALCAN數(shù)據(jù)庫通過β值指示DNA甲基化的水平，范圍從0(未甲基化)到1(完全甲基化)。不同的β截止值來表示高甲基化[β值：0.7～0.5]或低甲基化[β值：0.3～0.25][23-24]。

1.7 LIFR在乳腺癌中的表達(dá)與作用 通過TRizol法提取細(xì)胞中總RNA，用分光光度計(jì)OD-1000+Spectrophotometer測定RNA濃度及純度后，采用諾維贊HiScript Q RT SuperMix for qPCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用諾維贊SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)進(jìn)行RT-qPCR，對比高侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中LIFR表達(dá)水平，所有操作均按照說明書完成。LIFR過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA LIFR)及空載體質(zhì)粒(pcDNA 3.1)采購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，LIFR小干擾RNA(siRNA LIFR)及對照(siRNA NC)采購自廣州銳博生物科技有限公司，采用美國Invitrogen公司的Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)于4倍鏡下拍照，對比0、12、24、48以及72小時(shí)劃痕愈合情況并統(tǒng)計(jì)。

1.8 預(yù)測LIFR上游miRNA 通過miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)[25-26]、TargetScan_7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)[27-28]、microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/home.do)[29-30]、miRDB(http://mirdb.org/index.html)[31-32]數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測LIFR上游miRNA,并利用Venny 2.1繪制韋恩圖。構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒，分別與miR-27a模擬物mimics miR-27a及陰性對照mimics NC共轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔白色酶標(biāo)板中，每孔約1×105細(xì)胞。按照Dual-Glo?Stop & Glo?Substrate：Dual-Glo?Stop &Glo?Substrate Buffer=100∶1的比例配置Dual-Glo?Stop & Glo?Reagen；按照每孔50 μl培養(yǎng)基加入50 μl Dual-Glo?Luciferase Reagent，室溫避光孵育10 min后測量各組螢火蟲熒光值；避光條件下，每孔加入50 μl Dual-Glo?Stop & Glo?Reagent；室溫孵育10 min后測量各組海腎熒光值；計(jì)算螢火蟲熒光值與海腎熒光值比值。

2 結(jié)果

2.1 LIFR在泛癌中的mRNA表達(dá)水平 為了研究LIFR在不同類型腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)差異，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析不同腫瘤類型的LIFR的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示,除中樞系統(tǒng)癌癥與淋巴瘤外，與正常組織相比，癌組織LIFR的表達(dá)普遍較低(圖1A)。進(jìn)一步，我們使用TIMER數(shù)據(jù)庫在線分析了LIFR在多種惡性腫瘤組織與其鄰近的正常組織中LIFR的表達(dá)差異，如圖1B所示。相比于正常組織，LIFR的表達(dá)在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、浸潤性乳腺癌(breast invasive carcinoma，BRCA)、膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、結(jié)腸癌(colon adenocarcinoma，COAD)、食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)、腎嫌色細(xì)胞癌(kidney chromophobe，KICH)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)、肝細(xì)胞癌(liver hepatocellular carcinoma，LIHC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma，PRAD)、直腸腺癌(rectum adenocarcinoma，READ)、胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma，THCA)、子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)中顯著下調(diào)。

2.2 LIFR表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

利用UCSC Xena網(wǎng)站下載TCGA數(shù)據(jù)庫中33種腫瘤類型的突變數(shù)據(jù)，進(jìn)一步研究LIFR的基因表達(dá)水平與腫瘤突變負(fù)荷的相關(guān)性。結(jié)果顯示，LIFR表達(dá)水平與乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large b-cell lymphoma，DLBC)、食管癌、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，LAML)、腦低度膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma，LGG)、肝細(xì)胞癌、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)、前列腺癌、惡性間葉腫瘤(sarcoma，SARC)、胃腺癌、甲狀腺癌、胸腺瘤(thymoma，THYM)、葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UVM)的腫瘤突變負(fù)荷具有相關(guān)性，其中與急性髓性白血病、惡性間葉腫瘤和胸腺瘤為正相關(guān)，其余皆為負(fù)相關(guān)(圖2A)。分析LIFR表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)性，結(jié)果表明，LIFR表達(dá)水平與乳腺癌、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)、胃腺癌和甲狀腺癌皆為負(fù)相關(guān)(圖2B)。

2.3 LIFR與乳腺癌腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性 利用“ESTIMATE”R包計(jì)算乳腺癌樣品的免疫打分與基質(zhì)打分后與LIFR的基因表達(dá)文件取交集并將結(jié)果輸出，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIFR的表達(dá)量和浸潤性乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞含量成正相關(guān)，即乳腺癌中LIFR表達(dá)量越高腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞所占成分越大(圖3)。

1A：Oncomine數(shù)據(jù)庫中的正常組織與不同癌癥中LIFR表達(dá)水平比較；1B：TIMER數(shù)據(jù)庫分析TCGA數(shù)據(jù)集中不同腫瘤類型的LIFR表達(dá)水平。***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05圖1 不同類型腫瘤中LIFR的表達(dá)水平

2A：LIFR表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)系數(shù)雷達(dá)圖；2B：LIFR表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)系數(shù)雷達(dá)圖。***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05圖2 LIFR表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)性

圖3 LIFR表達(dá)量與乳腺癌腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性

2.4 LIFR對乳腺癌的預(yù)后影響 通過PrognoScan評估LIFR表達(dá)水平高低對患者生存率的影響可以發(fā)現(xiàn)，LIFR的表達(dá)主要影響腦腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌，高LIFR表達(dá)提示患者預(yù)后較好。其中我們重點(diǎn)分析了LIFR對乳腺癌的預(yù)后價(jià)值(表1，圖4)，結(jié)果顯示,高表達(dá)LIFR乳腺癌患者有較好的總生存期、腫瘤無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期和無復(fù)發(fā)生存期。通過Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫，基于Affymetrix微陣列進(jìn)一步分析LIFR對乳腺癌的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果顯示，LIFR低表達(dá)與乳腺癌(OSHR=0.55，95%CI=0.4～0.76，P=0.002；DMFSHR=0.68，95%CI=0.49～0.94，P=0.02；RFSHR=0.66，95%CI=0.56～0.77，P=1.3e-07)的不良預(yù)后有關(guān)。

表1 LIFR表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 免疫和分子亞型中LIFR基因的表達(dá) 通過TISIDB數(shù)據(jù)庫所匯總的跨TCGA數(shù)據(jù)集的各種癌癥LIFR的基因表達(dá)情況及與免疫和分子亞型的關(guān)系見圖5。

2.6 乳腺癌中LIFR啟動子甲基化水平 通過UALCAN分析LIFR在乳腺癌中啟動子甲基化水平發(fā)現(xiàn)，LIFR在乳腺癌中表現(xiàn)為低甲基化。乳腺癌不同亞型、分期、組織學(xué)分類、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、年齡的LIFR啟動子甲基化差異情況見圖6。

2.7 LIFR在乳腺癌中低表達(dá)并抑制乳腺癌細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LIFR在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中的基因表達(dá)水平顯著低于低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖7A)。進(jìn)一步通過在MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，干擾或過表達(dá)LIFR的水平后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，干擾LIFR表達(dá)后，在第42與第72小時(shí)的劃痕愈合速度明顯快于對照組(siRNA NC)，而過表達(dá)LIFR后，在第42與第72小時(shí)劃痕愈合速度慢于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(pc DNA 3.1)(圖7B、7C)，說明LIFR能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

2.8 LIFR是miR-27a的直接靶點(diǎn) 為了探究LIFR與微小RNA(microRNA，miRNA)的關(guān)系，通過對miRTarBase、TargetScan_7.2、microRNA.org和miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測取交集繪制韋恩圖，發(fā)現(xiàn)，miR-27a為LIFR的上游靶點(diǎn)(圖8A)；構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果表明，miR-27a可以直接與LIFR的3’UTR區(qū)域靶向結(jié)合(圖8B)。

注：PrognoScan(4A～4L)和Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(4M～4O);4A～4C：LIFR表達(dá)水平高低與乳腺癌OS；4D～4H：LIFR表達(dá)水平高低與乳腺癌RFS;4I～4K：LIFR表達(dá)水平高低與乳腺癌DSS；4L：LIFR表達(dá)水平高低與乳腺癌DMFS；4M～4O乳腺癌OS、DMFS、RFS曲線圖4 Kaplan-Meier生存曲線顯示LIFR表達(dá)水平高低與乳腺癌預(yù)后關(guān)系

5A：LIFR表達(dá)與不同腫瘤類型免疫亞型的關(guān)系；5B：乳腺癌不同免疫亞型中LIFR的基因表達(dá)水平；5C：LIFR表達(dá)與不同類型腫瘤分子亞型的關(guān)系；5D：LIFR在乳腺癌不同亞型中的基因表達(dá)水平圖5 TISDB數(shù)據(jù)庫分析LIFR的基因表達(dá)水平與免疫和分子亞型的關(guān)系

3 討論

本研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫以及TIMER數(shù)據(jù)庫在線分析發(fā)現(xiàn)，LIFR在多種癌癥中表達(dá)下調(diào)。已有研究證明，LIFR能夠抑制胰腺癌[33]、肺腺癌[34]、肝癌[35]、胃癌[36]、乳腺癌[13]等多種癌癥的轉(zhuǎn)移抑制因子，且與食管癌治療中耐藥具有相關(guān)性[37]。通過PrognoScan以及Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIFR主要與腦腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌以及卵巢癌的預(yù)后有關(guān)。對乳腺癌，LIFR主要影響了乳腺癌患者的總生存期、無復(fù)發(fā)生存期和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期，乳腺癌中LIFR高表達(dá)往往提示患者具有更好的預(yù)后，LIFR的表達(dá)缺失往往提示患者的預(yù)后較差。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的LIFR能夠抑制細(xì)胞遷移能力，而低表達(dá)LIFR后乳腺癌細(xì)胞遷移能力則明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步分析LIFR表達(dá)水平與腫瘤突變負(fù)荷及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，LIFR表達(dá)水平與乳腺癌、結(jié)腸癌、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、腦低度膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、前列腺癌、胃腺癌、甲狀腺癌、葡萄膜黑色素瘤的腫瘤突變負(fù)荷負(fù)相關(guān)(即LIFR表達(dá)水平越高，每兆堿基中突變的總數(shù)越少)，與急性髓性白血病、惡性間葉腫瘤和胸腺瘤為正相關(guān)。腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)即腫瘤組織每兆堿基中突變的總數(shù)，是指一份腫瘤樣本中相對的基因突變數(shù)量。目前來說，TMB越高，腫瘤被T細(xì)胞識別的可能性越大。乳腺癌中LIFR表達(dá)缺失，降低了機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng)，這可能是LIFR對乳腺癌的作用機(jī)制之一。腫瘤與免疫的相關(guān)研究是近年來的熱點(diǎn)。根據(jù)治療策略，腫瘤的免疫治療分為兩類。第一類是增強(qiáng)免疫激活機(jī)制，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來增強(qiáng)對腫瘤的免疫反應(yīng)，這種方法往往效果不理想，還會引發(fā)一系列副作用。第二類是免疫正?；?，修復(fù)腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中的抗腫瘤免疫力，最典型的為細(xì)胞程序性死亡(PD)途徑，該途徑在TME中上調(diào)抑制了效應(yīng)T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，阻斷該途徑能夠有效改善多種腫瘤類型的抗腫瘤免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,非小細(xì)胞肺癌中TMB和PD-L1表達(dá)是兩個(gè)獨(dú)立的變量，但是卻具有相似的預(yù)測能力，而將TMB和PD-L1表達(dá)均納入多變量預(yù)測模型時(shí)，可獲得更好的免疫治療預(yù)測能力，具備更佳的臨床指導(dǎo)價(jià)值[38]。PD-L1在Her-2陽性乳腺癌患者中具有獨(dú)立的不良預(yù)后影響[39-41]。相當(dāng)一部分Her-2陽性乳腺癌病例中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)、PD-L1升高，這可能增加機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)的發(fā)生概率，使得這一部分患者有更大的概率從免疫治療中獲益[42]。

6A：不同組織類型中；6B：不同亞型中；6C：不同分期中；6D：不同組織學(xué)分類中；6E：不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期中；6F：不同年齡分期中。***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05圖6 乳腺癌中LIFR啟動子甲基化水平

7A：LIFR mRNA在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231與低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MCF7之間的表達(dá)差異；7B、7C：劃痕實(shí)驗(yàn)比較干擾(siRNA LIFR)或過表達(dá)(pcDNA LIFR)后乳腺癌細(xì)胞遷移能力的變化，測量第0、12、24、48和72小時(shí)劃痕面積并統(tǒng)計(jì)圖7 LIFR在乳腺癌中低表達(dá)并抑制乳腺癌細(xì)胞遷移能力

8A：通過miRTarBase、TargetScan_7.2、microRNA.org和miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測LIFR的上游靶點(diǎn)，結(jié)果顯示miR-27a為共同預(yù)測結(jié)果；8B：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-27a可以直接靶向LIFR的3’UTR區(qū)域圖8 LIFR是miR-27a的下游靶基因

未來免疫介導(dǎo)的抗腫瘤機(jī)制可能會在腫瘤治療中發(fā)揮更大的作用，通過研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因，尋找其與免疫的關(guān)聯(lián)，將使免疫治療的作用進(jìn)一步放大，為癌癥患者帶來更多益處。