過氧化物氧化還原酶蛋白1在乳腺癌組織中表達及對乳腺癌細胞生長調(diào)控機制的研究

王桂臣,薛鳴,高陽

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。在歐美國家,每年新檢出約6萬例原位癌患者及24萬例浸潤性癌患者,死亡率接近1/6[1-2]。在我國,隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,人們的性觀念、生活習(xí)慣發(fā)生改變,乳腺癌的發(fā)病率也呈逐漸上升趨勢[3]。目前認(rèn)為,乳腺癌的發(fā)生是一個多階段、多步驟并且多種分子參與的發(fā)病過程[4]。過氧化物氧化還原酶蛋白1(peroxiredoxin1,PRDX1)是一類具有調(diào)節(jié)細胞活性氧、維持細胞穩(wěn)態(tài)作用的蛋白[5]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),PRDX1具有原癌基因的特征,在胃癌[6]、肝細胞癌[7]等多種惡性腫瘤中存在表達異常,但在乳腺癌中報道很少。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 人正常乳腺上皮細胞MDA-kb2購于南京諾唯贊生物科技有限公司;乳腺癌細胞系MCF7、MDA-MB-453、MDA-MB-231由本實驗室傳代培養(yǎng)。PCR引物、RT-PCR試劑盒購于美國瑞普斯生物科技有限公司;PI3K、AKT抗體購于美國BioInnovatise生物技術(shù)公司;PRDX1小干擾 RNA(PRDX1 siRNA)、小干擾 RNA 陰性對照(siRNA control)均購于美國Selleck生物科技有限公司。

1.2 組織樣本來源 選擇2017年4月至2019年2月在北大醫(yī)療魯中醫(yī)院進行手術(shù)治療的86例乳腺癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者為首次診斷；②在我院行手術(shù)治療，術(shù)后病理確診為乳腺癌；③標(biāo)本保存于我院病理科，且包括癌組織、癌旁組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前曾行放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療；②臨床資料不完全。同時,收集同時期82例因乳腺腺瘤等良性疾病行手術(shù)治療的患者為陰性對照。本研究通過我院倫理委員會審查通過,患者對本研究知情同意。

1.3 免疫組化 組織均經(jīng)甲醛固定后,石蠟包埋,切片。對組織切片進行常規(guī)脫蠟、水化,H2O2去離子水孵育。高溫修復(fù)抗原,PBS沖洗,滴加100 μl鼠抗人PRDX1單克隆抗體(濃度1∶100),4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次,每次2 min。滴加二抗,37 ℃孵育20～30 min。PBS沖洗3次,每次2 min。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。以出現(xiàn)棕色顆粒作為PRDX1陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將乳腺癌細胞株MCF7、MDA-MB-453、MDA-MB-231置于完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),在37℃、5% CO2孵箱中孵育,經(jīng)胰酶數(shù)次消化傳代后,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。接種于24孔板,當(dāng)細胞匯合度達約60%時,應(yīng)用 LipofectinTM2000進行轉(zhuǎn)染,根據(jù)實驗方案,分為:①未轉(zhuǎn)染的空白對照組；②siRNA-NC(陰性對照)組；③PRDX1-siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染4 h后在新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 MTT檢測 根據(jù)實驗分組方案,分別更換空白對照組、siRNA-NC組和PRDX1-siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞培養(yǎng)液,同時培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,于每孔細胞加入20 μl MTT溶液,孵育4 h,檢測570 nm波長處的吸光度(A值)。生長抑制率=1-藥物組A570 nm值/對照組A570 nm值。實驗均重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR檢測 根據(jù)操作說明書步驟,提取細胞總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PRDX1引物序列:上游5’-CATCAAGAATGTTGCAGCCAAA-3’,下游5’-TTTCGCGTACACTGCTTAGATCA-3’,以β-actin作為內(nèi)參。所有引物序列均由南京諾唯贊生物科技有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性10 min,然后95 ℃變形30 s,50 ℃退火30 s,40個循環(huán),最后70 ℃延伸10 min結(jié)束。

1.7 Western blot檢測 收集各分組的實驗細胞,應(yīng)用RIPA裂解液裂解細胞樣品并提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度?；旌仙蠘泳彌_液,煮沸變性,電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育、ECL法顯影定影。通過Quantity One軟件分析條帶強度,以β-actin為內(nèi)參,檢測PI3K蛋白、AKT蛋白表達。

1.8 流式細胞檢測 細胞傳代、消化后,轉(zhuǎn)移至離心管,室溫下,1 000 g,離心10 min,棄去上清。添加細胞培養(yǎng)液,調(diào)整細胞濃度約為106/ml,分別加入Buffer 200 μl、Annexin V-FITC 10 μl及PI 10 μl,避光反應(yīng)15 min。再次加入Buffer 300 μl,上機,流式細胞儀檢測凋亡率,每組細胞重復(fù)檢測3次,取平均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS2 0.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較的統(tǒng)計分析采用方差分析檢驗,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRDX1在乳腺癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達 免疫組化染色顯示,PRDX1在乳腺癌及癌旁組織中的陽性率為58.1%(50/86)、23.3%(20/86),在正常組織中的陽性率為3.7%(3/82),PRDX1在乳腺癌組織中的陽性率最高,見圖1。

1A:正常組織;1B:癌旁組織;1C:胃癌組織圖1 PRDX1在正常組織、癌旁組織、乳腺組織的表達(SP ×200)

2.2 PRDX1表達對乳腺癌臨床特征的影響 PRDX1陽性表達與乳腺癌患者的TNM分期、病理分級有關(guān)(P<0.05),但對患者雌激素受體、孕激素受體表達與否無關(guān)(P>0.05),見表1。

表1 PRDX1表達對乳腺癌臨床特征的影響

2.3 PRDX1 mRNA在胃癌細胞系及正常胃上皮細胞中的表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示,PRDX1 mRNA在乳腺癌細胞系MCF7、MDA-MB-453、MDA-MB-231中的表達水平高于正常乳腺上皮細胞MDA-kb231(P<0.05)。而PRDX1 mRNA在乳腺癌細胞系MCF7中的表達水平最高,因此選擇MCF7細胞進行后續(xù)實驗(圖2)。

圖2 各組細胞中PRDX1 mRNA相對表達量

2.4 轉(zhuǎn)染PRDX1 siRNA后MCF7細胞中PRDX1表達 Western blot檢測結(jié)果顯示,空白組與siRNA-NC組的PRDX1蛋白表達水平,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而PRDX1-siRNA組細胞中PRDX1蛋白表達水平下降(P<0.05),見圖3。乳腺癌細胞系MCF7中的表達水平最高,因此選擇MCF7細胞進行后續(xù)實驗。

圖3 Western blot檢測各組細胞PRDX1蛋白表達

2.5 三組細胞增殖活性及凋亡率比較 MTT檢測結(jié)果顯示,在24 h、48 h、72 h時,siRNA-NC組的細胞抑制率分別為1.6%、1.7%、2.4%,RDX1-siRNA組分別為5.6%、15.3%、38.4%,RDX1-siRNA組的細胞抑制率高于空白組與siRNA-NC組(P<0.05)。流式細胞檢測顯示,空白組、siRNA-NC組、RDX1-siRNA組的凋亡率分別為(7.7±1.3)%、(7.4±1.5)%、(25.7±4.2)%,RDX1-siRNA的腫瘤凋亡率最高(P<0.05),見圖4。

圖4 流式細胞檢測細胞凋亡

2.6 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達 Western blot檢測顯示,siRNA-NC組的PI3K蛋白、AKT蛋白表達量與空白組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但RDX1-siRNA組中PI3K蛋白、AKT蛋白的表達量下降(P<0.05),見圖5。

圖5 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達

3 討論

由于乳腺癌篩查的逐漸普及,乳腺癌在特定人群中的檢出率有所提高,低危腫瘤、癌前病變和導(dǎo)管原位癌的發(fā)病率均有所升高[8]。有研究顯示,由于絕經(jīng)后激素治療和乳腺鉬靶應(yīng)用廣泛,導(dǎo)管原位癌和浸潤性乳腺癌的發(fā)病率開始升高[9]。盡管內(nèi)分泌治療可以降低對側(cè)乳腺癌的風(fēng)險,但確診10年后對側(cè)出現(xiàn)原發(fā)乳腺癌的風(fēng)險為3%～10%。PRDX1在胃癌、結(jié)腸癌等消化道癌癥中的研究較多,但在乳腺癌中研究較少。

PRDX1作為一種過氧化物酶,在維持體內(nèi)過氧化氫水平方面起著關(guān)鍵作用;同時,PRDX1還可通過調(diào)控蛋白激酶的氧化還原狀態(tài)參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控過程[10]。目前的研究發(fā)現(xiàn),PRDX1具有某些原癌基因的特征,在正常組織內(nèi)低表達或不表達,并發(fā)揮一些重要的生理功能。但在特定條件下,PRDX1基因可被異常激活,誘導(dǎo)細胞癌變[11]。在本研究中,我們首先對患者臨床標(biāo)本中PRDX1的表達進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRDX1在乳腺癌癌組織中的陽性率較高;同時,PRDX1陽性表達對乳腺癌患者的TNM分期、病理分級有影響。這表明,PRDX1參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,并對患者的臨床病理特征產(chǎn)生了不良影響。

RNA干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)提供了一種經(jīng)濟、快捷、高效的抑制特異基因表達的技術(shù)手段,有助于研究該基因在生物模型系統(tǒng)中的作用,并逐步成為遺傳性疾病、腫瘤疾病等基因治療研究的一種手段[12]。在本研究中,我們利用RNA干擾技術(shù)敲低了乳腺癌細胞株中PRDX1基因的表達,將乳腺癌細胞分為空白組、siRNA-NC組及PRDX1-siRNA組,通過MTT檢測發(fā)現(xiàn),PRDX1-siRNA組的細胞抑制率高于空白組與siRNA-NC組。這表明,PRDX1基因的表達缺失對腫瘤細胞的生長起到了的消極作用,生長速度明顯下降。進一步的流式細胞檢測發(fā)現(xiàn),空白組、siRNA-NC組、PRDX1-siRNA組的凋亡率分別為(7.7±1.3)%、(7.4±1.5)%、(25.7±4.2)%,PRDX1-siRNA的腫瘤凋亡率最高?！凹毎蛲觥笔侵赣苫蚩刂频募毎灾鞯挠行蛩劳?其意義在于細胞可主動清除多余的特異性或分化能力與機體PRDX1基因表達有利于誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

不相適應(yīng)的、以及已經(jīng)完成功能而又不再應(yīng)用的細胞,臨床使用的放射療法和化療藥物主要就是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮療效[13]。這表明,降低PI3K-AKT是一條經(jīng)典的信號通路,主要作用包括[14-15]:①誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1的表達和活性;②作為細胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;③在細胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能。在本研究中,通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與空白組相比,PRDX1-siRNA組中PI3K蛋白、AKT蛋白的表達量下降。這表明,PRDX1是通過降低PI3K-AKT信號通路活性發(fā)揮效應(yīng)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),PRDX1在乳腺癌患者中的陽性率明顯提高。在MCF7乳腺癌細胞株中,抑制PRDX1表達水平可通過降低PI3K/AKT信號通路活性,促進乳腺癌細胞凋亡。