三陰性乳腺癌腫瘤微環(huán)境特征免疫相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物篩選及功能預(yù)測分析

蘇芃， 毛曉韻， 關(guān)舒， 崔夢(mèng)遙， 金紫凝， 金鋒

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的特殊亞型，其特征為缺乏雌激素受體(ER)和孕激素受體(PgR)的表達(dá)，以及缺乏人表皮生長因子受體2(HER2)的表達(dá)。一直以來TNBC由于其具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性和顯著的耐藥性而備受關(guān)注[1]。又因缺少有效的治療靶點(diǎn)，TNBC患者的數(shù)量雖然只占乳腺癌患者總數(shù)的20%[2]，但是死亡人數(shù)卻占所有乳腺癌患者死亡人數(shù)的80%[3]。研究表明，大多數(shù)TNBC患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移后，中位總生存時(shí)間(overall survival, OS)為12～18個(gè)月[4]。隨著全球TNBC患者不斷增加，尋找有效的治療靶點(diǎn)和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物成為TNBC臨床和科研的重點(diǎn)及難點(diǎn)。

目前手術(shù)和放化療仍是治療TNBC的常規(guī)方式。目前批準(zhǔn)的化療藥物包括蒽環(huán)類、紫杉類和鉑類等[5-7]，但是由于TNBC的致癌因子和耐藥性的異質(zhì)性，這些化療藥物的療效非常有限[8-9]。既往研究表明，在其他實(shí)體性腫瘤中，患者可以通過免疫治療獲益。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)已經(jīng)被證明是目前最有效的免疫治療藥物，其能阻斷免疫抑制受體(CTL-4和PD-1)提高腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)的細(xì)胞毒性和增殖能力[10-17]。相比其他乳腺癌亞型，TNBC被認(rèn)為是最有可能從免疫治療中獲益的。首先，TNBC中存在大量的TILs，而TILs在其他腫瘤中已經(jīng)被證明與ICIs療效呈正相關(guān)；其次，在TNBC中PD-L1的表達(dá)在腫瘤組織和免疫細(xì)胞中均高表達(dá)，這為ICIs提供了直接的治療靶標(biāo)；再次，TNBC中存在大量的非同義突變，它們會(huì)產(chǎn)生腫瘤異質(zhì)性新抗原，從而激活抗原異質(zhì)性T細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。但是目前還沒有一種有效的治療TNBC的免疫治療方案。

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)已經(jīng)被證明是腫瘤潛在治療靶點(diǎn)的重要來源之一，其有很高的復(fù)雜性，且越來越多的文獻(xiàn)表明，TME在腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[18-19]。例如，在診斷時(shí)可以通過TME的細(xì)胞成分預(yù)測免疫治療療效[20-21]和化療受益[22]。已經(jīng)證明，TME中的CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞數(shù)量的變化與乳腺癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)[23]。所以如何正確理解TNBC患者的TME是免疫治療TNBC的重中之重。

本研究利用生物信息學(xué)分析方法評(píng)價(jià)TNBC患者中的免疫微環(huán)境細(xì)胞浸潤情況，希望從免疫微環(huán)境層面對(duì)TNBC患者的預(yù)后進(jìn)行分析，進(jìn)而提出新的TNBC免疫預(yù)后相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物并描述其在TNBC中的生物學(xué)過程，為臨床治療TNBC提供新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與標(biāo)準(zhǔn)化 系統(tǒng)檢索TNBC相關(guān)公開數(shù)據(jù)庫并篩選樣本，篩選標(biāo)準(zhǔn)：①數(shù)據(jù)集包含mRNA表達(dá)及生存數(shù)據(jù)；②TNBC患者樣本數(shù)>40；③患者總生存時(shí)間>10 d；④術(shù)前未接受過抗腫瘤治療。芯片測序數(shù)據(jù)通過RMA算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)于一個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)探針的情況，取表達(dá)量的中位數(shù)作為該基因的表達(dá)量，并將基因表達(dá)中位數(shù)為0標(biāo)準(zhǔn)差小于0.1的基因剔除。

1.2 CIBERSORT 通過CIBERSORT算法[24]評(píng)價(jià)TNBC中免疫細(xì)胞成分包括：B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和髓細(xì)胞亞群等22種免疫細(xì)胞。該算法通過CIBERSORT官方網(wǎng)站(http://cibersort.stanford.edu/)實(shí)現(xiàn)，提取P<0.05的分析結(jié)果。

1.3 一致性聚類分析 采用無監(jiān)督聚類法(K-means)對(duì)TNBC患者的免疫細(xì)胞成分進(jìn)行聚類，尋找最佳的分類類型。此算法通過R包(Consensu Cluster Plus)實(shí)現(xiàn)[25]，并通過1 000次交叉驗(yàn)證證明數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。

1.4 基因差異分析 采用差異基因分析探索TNBC中表達(dá)量異常的基因。通過R包(limma)實(shí)現(xiàn)，并對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。截?cái)嘀档倪x擇為|log2foldChange(FC)|≥1并且調(diào)整后P<0.05，即TNBC中基因表達(dá)量超過癌旁組織中表達(dá)量的2倍或降低2倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異的基因即為差異基因。

1.5 基因富集分析 為了計(jì)算單樣本基因集富集度，我們使用GSEA分析[26-27]推導(dǎo)出先前實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的基因特征的絕對(duì)富集分?jǐn)?shù)，通過R包(Cluster Profiler)[28]進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，提示基因集主要富集的通路，注釋其參與的生物學(xué)過程。

1.6 Lasso-Logistic及ROC驗(yàn)證 為了準(zhǔn)確篩選免疫亞型的生物標(biāo)志物，我們通過lasso-logistic模型[29]進(jìn)行降維篩選。lasso-logistic回歸模型的目標(biāo)函數(shù)如下：

其中，λ表示懲罰系數(shù)，可以通過10折交叉驗(yàn)證選取最優(yōu)λ，||α||1定義為每個(gè)向量元素絕對(duì)值之和。lasso-logistic模型通過R包(glmnet)實(shí)現(xiàn)。受試者工作特征曲線(ROC)用來評(píng)價(jià)降維后數(shù)據(jù)與免疫亞型之間的關(guān)系，ROC曲線下面積(AUC)越大，說明通過降維后數(shù)據(jù)分類的結(jié)果越好。

1.7 網(wǎng)絡(luò)加權(quán)共表達(dá)分析(WGCNA) 網(wǎng)絡(luò)加權(quán)共表達(dá)分析是利用分子間的表達(dá)相關(guān)系數(shù)來衡量它們的共表達(dá)關(guān)系，同一模塊中的分子表達(dá)模式相似，而和其他模塊分子表達(dá)模式差別較大。WGCNA中使用的方法就是使用dissimilarity來進(jìn)行聚類，其采用的具體算法是拓?fù)渲丿B(topological overlap dissimilarity measure，TOM)以計(jì)算基因間的關(guān)聯(lián)程度[30]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究運(yùn)用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)及四分位間距來表示，組間比較采用Wilcoxon檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法生成各數(shù)據(jù)集中各亞組的生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)確定差異的統(tǒng)計(jì)顯著性，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象特征 檢索GEO公開數(shù)據(jù)庫，下載GSE103091數(shù)據(jù)，通過整理共納入包含mRNA數(shù)據(jù)和完整總生存數(shù)據(jù)的TNBC患者100例?；颊咂骄挲g為(57.0±13.1)歲；生存72例，死亡28例，中位生存時(shí)間為66.47個(gè)月；70例患者未轉(zhuǎn)移，30例(30%)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

2.2 一致性聚類分析(Consensus Cluster) 為選擇最合適的分組，本研究通過R包(Consensus Cluster Plus)進(jìn)行，通過一致性聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBC患者免疫細(xì)胞成分可分為兩類，一類為低免疫浸潤組，一類為高免疫浸潤組。低免疫浸潤組患者43例，其中轉(zhuǎn)移患者19例(44.2%)；高免疫浸潤組患者57例，其中轉(zhuǎn)移患者11例(19.3%)，兩組轉(zhuǎn)移患者比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.09，P=0.01)，見圖1。通過生存分析發(fā)現(xiàn)低免疫浸潤組患者總生存較低，預(yù)后不良，見圖2。通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)低免疫浸潤組人群主要受到正向免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路和細(xì)胞刺激因子相關(guān)通路的調(diào)控，見圖3，表1。

表1 免疫低浸潤組功能富集分析

圖1 三陰性乳腺癌免疫成分的一致性聚類分析

圖2 免疫分組相關(guān)生存分析

圖3 低免疫浸潤組的功能富集分析

2.3 基因差異分析 通過R包(limma)對(duì)TNBC患者的癌與癌旁組織樣本進(jìn)行基因差異分析，得到1 304個(gè)差異基因，其中422個(gè)為高表達(dá)差異基因，882個(gè)為低表達(dá)差異基因。

2.4 篩選免疫分組的生物學(xué)標(biāo)志物 為了篩選上述免疫分組的生物學(xué)標(biāo)志物，我們通過1 000次Lasso-Logistic對(duì)TNBC差異分析基因進(jìn)行降維分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有36個(gè)基因可以作為免疫分組的生物學(xué)標(biāo)志物(圖4)，通過單因素Cox分析篩選與TNBC患者總生存相關(guān)的基因1 726個(gè)。上述結(jié)果相互取交集，得到36個(gè)免疫分組生物學(xué)標(biāo)志物中有5個(gè)基因與TNBC患者總生存相關(guān)，見圖5。通過ROC驗(yàn)證此5個(gè)基因可以有效地反映免疫分組情況，AUC面積為0.946，見圖6。

4A：1 000次lasso logistic中每次分析的基因組合；4B：1 000次分析中各個(gè)基因出現(xiàn)的次數(shù)，黑色虛線為出現(xiàn)900次，黑色虛線以上為該基因出現(xiàn)過900次以上圖4 免疫分型生物學(xué)標(biāo)志物篩選

圖5 免疫分型核心基因篩選

圖6 核心基因的ROC曲線分析

2.5 免疫分組生物學(xué)標(biāo)志物的生物功能分析 為了描述上述分析得到的5個(gè)免疫分組生物學(xué)標(biāo)志物(FOLH1、WDR18、LINC00638、OAS3、SETDB2)，我們采用WGCNA進(jìn)行共表達(dá)分析，再通過基因富集分析描述與此5個(gè)基因共表達(dá)模塊的生物學(xué)功能，推測此5個(gè)基因的生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OLH1共表達(dá)在黑色模塊中，WDR18共表達(dá)在天青色模塊中，這兩個(gè)基因主要生物學(xué)功能與腫瘤增殖相關(guān)；LINC00638共表達(dá)在棕色模塊中，主要生物學(xué)功能與T細(xì)胞激活等免疫相關(guān)；OAS3共表達(dá)在黃綠色模塊中，主要生物學(xué)功能與病毒基因降解通路相關(guān)；SETDB2被分類在灰色模塊中，由于灰色模塊為非聚類基因集合，所以SETDB2在TNBC中發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步研究。見圖7。

3 討論

腫瘤微環(huán)境的改變已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是可以影響TNBC患者預(yù)后的重要靶標(biāo)。但是我們發(fā)現(xiàn)目前對(duì)于腫瘤微環(huán)境與TNBC的研究略有不足，而且還沒有通過免疫微環(huán)境細(xì)胞成分分析TNBC患者預(yù)后的研究。本研究對(duì)TNBC患者的免疫微環(huán)境細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行分析，提出5個(gè)免疫相關(guān)預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，并描述了其在TNBC患者中的生物功能，為TNBC免疫治療提供了新的靶點(diǎn)。

有研究已經(jīng)證實(shí)，TNBC并不是傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中的單一類型，同為TNBC亞型的患者存在著較大的生存差異，對(duì)不同治療方案的敏感性也不同。這與本研究的結(jié)論相同。本研究通過Cibersort對(duì)TNBC患者的TME細(xì)胞成分進(jìn)行分析，并且發(fā)現(xiàn)TNBC患者可以通過TME細(xì)胞成分分為兩組，即“高免疫浸潤組”和“低免疫浸潤組”。結(jié)果顯示，低免疫浸潤組的人群預(yù)后不良，并且通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)低免疫浸潤組人群中正向免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路和細(xì)胞刺激因子相關(guān)通路發(fā)揮了重要的作用。通過1 000次logisticlasso回歸進(jìn)行特征選取，最后篩選出5個(gè)基因(FOLH1、WDR18、LINC00638、OAS3、SETDB2)為免疫相關(guān)預(yù)后標(biāo)志物，再通過WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，WDR18在TNBC參與mRNA編輯過程影響預(yù)后。有研究表明，WDR18可以與TopBP1共同促進(jìn)DNA損傷檢查點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)[31]，DNA損傷已經(jīng)被證明在乳腺癌中發(fā)揮重要的作用，與本研究的結(jié)果一致。還有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00638基因可以與HCP5、XIST和TP53TG1在新生兒敗血癥中通過內(nèi)源性RNA作用影響患兒預(yù)后[32]。LncRNA作為非編碼RNA本身沒有編碼蛋白的功能，但是其可以調(diào)節(jié)mRNA，是非常重要的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00638是TNBC免疫相關(guān)預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，參與T細(xì)胞激活等重要免疫通路，目前對(duì)于LINC00638的研究不足，還需要進(jìn)一步研究。據(jù)報(bào)道，SETDB2是1型IFN信號(hào)傳導(dǎo)下游的干擾素刺激基因(ISG)，并負(fù)責(zé)減弱Ⅰ型IFN和轉(zhuǎn)錄因子NFkB誘導(dǎo)的促炎和抗病毒基因[33-34]；SETDB2在腫瘤中的異常表達(dá)與患者的耐藥性有關(guān)[35]；SETDB2的低表達(dá)與晚期腎細(xì)胞腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有關(guān)[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC患者中SETDB2高表達(dá)患者的預(yù)后比SETDB2低表達(dá)患者的預(yù)后好，這說明在TNBC中SETDB2是一個(gè)重要的預(yù)后保護(hù)因素，但是SETDB2在TNBC中發(fā)揮的生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步的研究。OAS3作為經(jīng)典的干擾素靶基因，已經(jīng)被證實(shí)參與細(xì)胞凋亡過程[37]，并且與宮頸癌HPV感染相關(guān)且影響患者預(yù)后，迄今為止還沒有報(bào)道其與乳腺癌相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，OAS3在TNBC患者中參與病毒基因降解功能，其低表達(dá)患者預(yù)后不良，為TNBC的預(yù)后保護(hù)因素。

7A:TNBC免疫相關(guān)基因的共表達(dá)聚類分析；7B：FOLH1生物學(xué)功能預(yù)測；7C：WDR18生物學(xué)功能預(yù)測；7D：LINC00638生物學(xué)功能預(yù)測；7E：OA53生物學(xué)功能預(yù)測圖7 WGCNA及核心基因的生物學(xué)功能預(yù)測

綜上所述，本研究篩選出TNBC患者免疫相關(guān)預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志FOLH1、WDR18、LINC00638、OAS3及SETDB2，并通過驗(yàn)證它們可以反映TNBC患者的預(yù)后情況。但本研究還有一些缺點(diǎn)與不足：①研究的樣本量較小，對(duì)于TNBC總體人群的代表性有限，還需要后續(xù)大樣本的研究；②提出的生物學(xué)標(biāo)志物還需要分子細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的證明，分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的討論；③采用芯片測序技術(shù)，由于技術(shù)本身的限制，存在批次效應(yīng)有可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)的偏倚；④本研究分析結(jié)果還需要更多數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證。