白車軸草中總黃酮提取工藝研究

王軍捷 麥康明 溫雪兒

摘要：基于超聲波提取法探究提取白車軸草（Trifolium repens）中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件。以蘆丁為空白對照，總黃酮得率為考察指標(biāo)，通過亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法，采用單因素試驗(yàn)及L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計，研究超聲時間、乙醇濃度和液固比3種因素對白車軸草中黃酮類物質(zhì)提取率的影響。結(jié)果表明，白車軸草總黃酮提取的最佳工藝條件為超聲提取時間40 min、乙醇濃度50%、液固比60∶1（mL∶g）。在此條件下，白車軸草中總黃酮的提取率為2.853%。該試驗(yàn)設(shè)計方法高效、快速、經(jīng)濟(jì)，適用于白車軸草總黃酮提取工藝研究，并為白車軸草有效提取黃酮類物質(zhì)提供試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白車軸草（Trifolium repens）;總黃酮;正交試驗(yàn);提取工藝

Abstract： Based on the ultrasonic extraction method， the optimal technological conditions for extracting flavonoids from Trifolium repens was explored. With rutin as a blank control， the total flavonoid yield rate was an inspection index， and the effect of three factors， which were ultrasonic time， ethanol concentration and liquid-solid ratio， on the extraction rate of flavonoids in Trifolium repens was studied by the sodium nitrite-aluminum-sodium hydroxide method， single-factor test and L9（33） orthogonal test design. The results demonstrated that the optimal extraction process conditions of total flavonoids from Trifolium repens were ultrasonic time 40 min， ethanol concentration 50%， liquid-solid ratio of 60∶1（mL∶g）. Under these conditions， the extraction rate of total flavonoids in Trifolium repens was 2.853%.? The test design method was highly efficient， fast and economical. It was suitable for the research on the extraction process of total flavonoids from Trifolium repens and provided experimental basis for the effective extraction of flavonoids from Trifolium repens.

Key words： Trifolium repens; total flavonoids; orthogonal test; extraction process

白車軸草（Trifolium repens）系豆科車軸草屬（Trifolium）多年生草本植物，又名白花苜蓿、三消草、螃蟹花、金花草、菽草翹搖[1]，其株高10～40 cm，莖匍匐，無毛，三出復(fù)葉，具長柄、小葉倒卵形，邊緣具細(xì)鋸齒，托葉橢圓形，抱莖。車軸草類植物主要含有異黃酮類、三萜皂苷類、黃酮類以及芳香揮發(fā)性類成分，具有清熱涼血、祛痰止咳、鎮(zhèn)靜止痛的功效[2]。此外，白車軸草可作為防治土壤荒漠化和水土流失的良種，其能改善生態(tài)環(huán)境，在“退耕還草”中起著重要作用?，F(xiàn)有研究表明，黃酮類化合物具有消除疲勞、保護(hù)血管、預(yù)防動脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、抗脂肪氧化、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能，其藥理作用表現(xiàn)為抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗輻射、抗癌抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗心腦血管疾病等[3-7]，具有較高的藥用價值。

近年來，從植物中提取黃酮類物質(zhì)已成為天然藥物研究的熱點(diǎn)，但目前關(guān)于從白車軸草中提取黃酮類物質(zhì)的研究卻鮮有報道。因此為了有效地開發(fā)和利用車軸草屬植物資源，高效地從白車軸草中提取黃酮類物質(zhì)，本研究以白車軸草為試驗(yàn)材料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法從白車軸草中提取黃酮類物質(zhì)，對白車軸草中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為更好地開發(fā)白車軸草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和材料

KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司），WFJ-7200型可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限責(zé)任公司]，BS223S電子精密天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱PH-030（A）（上海大欣科學(xué)儀器有限公司）。

白車軸草（采自西南科技大學(xué)），蘆丁（中國藥品生物制品檢定所），乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 總黃酮測定方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將采摘的白車軸草清洗干凈，置于40 ℃的烘箱中干燥到一定程度（濕重631.57 g，干重84.42 g，干濕重比值0.134），粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0.01 g，置于50 mL的容量瓶中，加入適量70%的乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，靜置，得到濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取白車軸草粉末2.0 g，置于錐形瓶中，往其中加入一定濃度的乙醇溶液超聲提取，提取完成后，冷卻，過濾，取濾液，即得。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取0.20 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別置于10 mL的容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min;再加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min;繼續(xù)加入5%的氫氧化鈉溶液4 mL，加去離子水定容，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白組為對照，于510 nm波長處測定吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為A=11.071C-0.001 3，R2=0.997 4。由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在 0.004～0.020 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，吸光度值與濃度符合朗伯-比爾定律。

1.3 白車軸草總黃酮的測定

按“1.2.4”的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定總黃酮濃度，按下式計算總黃酮得率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲提取時間對總黃酮得率的影響 在設(shè)定液固比為30∶1（mL∶g，下同）、乙醇濃度為60%的基礎(chǔ)上，研究不同超聲提取時間20、30、40、50、60 min對總黃酮得率的影響及變化規(guī)律。由圖2可知，當(dāng)20 min≤超聲提取時間≤30 min時，隨超聲提取時間延長總黃酮得率逐漸增大，并在超聲提取時間為30 min時總黃酮得率達(dá)到最大;當(dāng)超聲提取時間>30 min時，總黃酮得率隨超聲提取時間延長而逐漸下降至趨于平緩。

2.1.2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 在設(shè)定液固比為30∶1、超聲提取時間為40 min的基礎(chǔ)上，研究不同乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%對總黃酮得率的影響及變化規(guī)律。由圖3可知，當(dāng)40%≤乙醇濃度≤50%時，總黃酮得率隨著乙醇濃度升高而不斷增大，并在乙醇濃度為50%時總黃酮得率達(dá)到最大;當(dāng)乙醇濃度>50%時，隨著乙醇濃度升高，總黃酮得率逐漸減小。

2.1.3 液固比對總黃酮得率的影響 在設(shè)定乙醇濃度為60%、超聲提取時間為40 min的基礎(chǔ)上，研究不同液固比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1對總黃酮得率的影響及變化規(guī)律。由圖4可知，當(dāng)20∶1≤液固比<50∶1時，隨液固比增大，總黃酮得率先減小后明顯增大，并在液固比為50∶1時達(dá)到最大。當(dāng)50∶1≤液固比≤60∶1時，總黃酮得率隨液固比增大而減小。

2.2 正交試驗(yàn)

為確定最佳提取條件，需全面考慮超聲提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果及有關(guān)資料，以總黃酮得率為考察指標(biāo)，將超聲提取時間、液固比、乙醇濃度3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，選取L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計[7]，得到提取白車軸草總黃酮的最佳工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響不同，極差R大小順序?yàn)锳 > C > B，即超聲提取時間>液固比>乙醇濃度，A因素（超聲時間）對總黃酮得率影響最大，B（乙醇濃度）對總黃酮得率影響最小。從k值得出，白車軸草總黃酮得率最高水平組合方案為A3B1C3，即超聲提取時間40 min，乙醇濃度50%，液固比60∶1（mL∶g）。在此因素水平下白車軸草總黃酮得率最高，為2.853%。由表3可知，因素A、B、C對總黃酮得率的影響均達(dá)到顯著水平（P<0.05），對總黃酮得率影響的主次順序?yàn)锳 > C > B，即超聲提取時間>液固比>乙醇濃度，與直觀分析結(jié)果一致。

3 小結(jié)與討論

在一定的乙醇濃度范圍內(nèi)，白軸草內(nèi)的黃酮類物質(zhì)的溶出速度隨著乙醇濃度升高而增加，乙醇濃度達(dá)50%時溶出速度達(dá)到平衡。隨著乙醇濃度繼續(xù)升高，一些醇溶性雜質(zhì)、色素和親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，從而影響黃酮類物質(zhì)的溶出速度[8]。因此，為達(dá)到黃酮的最高溶出速度，白車軸草總黃酮提取的最佳乙醇濃度為50%。

當(dāng)超聲提取時間過短時，黃酮類物質(zhì)還未充分溶出，超聲提取時間達(dá)30 min時黃酮類物質(zhì)的溶出速度達(dá)到最大。繼續(xù)延長超聲提取時間，對黃酮結(jié)構(gòu)有所破壞[9]，或超聲提取時間過長溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致乙醇濃度降低和部分總黃酮降解[10]，從而使總黃酮得率減小。同時基于節(jié)約時間的角度考慮，因此白車軸草總黃酮的最佳超聲提取時間為30 min。

在一定的液固比范圍內(nèi)，白車軸草內(nèi)的黃酮類物質(zhì)的溶出速度隨著液固比增大而增大，液固比為50∶1（mL∶g）時溶出速度達(dá)到最大。由于已經(jīng)浸出的黃酮對未浸出的黃酮有協(xié)同浸提作用，液固比繼續(xù)增大不利于協(xié)同浸提，且會使白車軸草內(nèi)的其它雜質(zhì)溶出，從而影響總黃酮得率。同時考慮到液固比過大將給后續(xù)的濃縮等操作帶來不便，因此白車軸草總黃酮提取的最佳液固比為50∶1（mL∶g）。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，3種因素對白車軸草總黃酮提取的影響主次順序?yàn)槌晻r間>液固比>乙醇濃度。白車軸草總黃酮提取的最佳工藝條件為超聲提取時間40 min、乙醇濃度50%、液固比60∶1（mL∶g），在此條件下白車軸草總黃酮得率為2.853%。本研究探討了白車軸草總黃酮的提取工藝，通過正交設(shè)計選出最佳工藝條件，為白車軸草有效提取黃酮類物質(zhì)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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