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    益母草苷通過誘導(dǎo)自噬減少HeG 2細(xì)胞體內(nèi)的脂質(zhì)蓄積

    2020-09-10 06:53:45張恒管玲玲田浩門秀麗
    康頤 2020年7期
    關(guān)鍵詞:自噬

    張恒 管玲玲 田浩 門秀麗

    【摘要】目的:建立高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積模型,探討益母草苷(Ajugol)對脂質(zhì)代謝的影響及其可能機制。方法:將HepG2細(xì)胞分為對照組(BSA組), BSA + Ajugol,Palmitate,Palmitate + Ajugol四組。通過油紅O染色觀察各組HepG2細(xì)胞體內(nèi)的脂肪含量,Ad-mCherry-GFP-LC3B檢測各組HepG2細(xì)胞體內(nèi)的自噬變化,Western blotting法檢測各組HepG2細(xì)胞體內(nèi)自噬的相關(guān)蛋白表達(dá)含量。結(jié)果:Ajugol實驗組中的LC3蛋白含量增多,并且ajugol實驗組中的脂質(zhì)有明顯減少。結(jié)論:Ajugol能促進(jìn)自噬減少HepG2細(xì)胞體內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。

    【關(guān)鍵詞】益母草苷;脂質(zhì)代謝;自噬;

    【中圖分類號】R29 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

    基金項目:國家自然科學(xué)基金資助課題(81370918)

    自噬是真核細(xì)胞內(nèi)的特有功能,它通過自噬體與溶酶體融合行成自噬溶酶體將細(xì)胞內(nèi)破損的細(xì)胞器,錯誤折疊的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)進(jìn)行降解[1]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)中藥中的有效成分有減少脂質(zhì)蓄積的作用,據(jù)報道熟地黃有緩解非酒精性脂肪肝的作用,但是目前不知道熟地黃中的成分ajugol是否具有緩解非酒精性脂肪肝的作用[2]。因此,通過建立HepG2細(xì)胞高脂模型,觀察ajugol是否對脂肪肝產(chǎn)生預(yù)防作用,為臨床防治脂肪肝提供新的實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、主要試劑

    人類肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞購自American Type Culture Collection公司。BCA蛋白測定試劑盒(中國北京碧云天生物公司),P62抗體(美國Sigma公司),油紅O染色液(中國北京索萊寶科技有限公司)。

    1.2主要試劑配制

    棕櫚酸酯(Palmitate)配制如下所述,棕櫚酸酯/牛血清白蛋白(BSA)耦合物是將20 mM的palmitate在0.01 M的NaOH孵育30 min以后,然后將5%無脂肪酸的BSA與palmitate以3:1的體積混合,所得到的共軛物含有5 mM的palmitate和3.75%的BSA。使用之前需用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

    1.3 免疫熒光

    在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次。用4%的多聚甲醛固定15min接著用1%Triton X-100室溫通透20min接著用PBS浸洗玻片3次,然后用BSA(1%)封閉30min。每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗,4℃孵育過夜,緊接著加熒光二抗,孵育室溫2h,隨后滴加DAPI避光孵育5min。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

    1.4 Real-time

    將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)約為5×105個。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后換成相應(yīng)的條件培養(yǎng)基收集細(xì)胞,按照試劑盒提取細(xì)胞總RNA,將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)結(jié)束后,確認(rèn)Real-time PCR的擴增曲線和熔解曲線,以2-ΔCt方法計算PPARα,p62和ATG7 mRNA表達(dá)水平。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組HepG2細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)水平以x±s表示,多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間均數(shù)兩兩比較采用t檢驗。以P=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組HepG2細(xì)胞中油紅O水平

    油紅O染色結(jié)果顯示, ajugol治療組能較明顯的減少脂質(zhì)在HepG2細(xì)胞上的聚集(P&lt;0.05或P<0.01)。

    2.2 各組HepG2細(xì)胞在激光共聚焦下的LC3表達(dá)水平

    與BSA實驗組相比,ajugol實驗組能明顯增強自噬體的數(shù)量,此外,palmitate + Ajugol實驗組中的自噬體較Palmitate實驗組的自噬體有所增加,結(jié)果表明ajugol能促進(jìn)自噬(P<0.05或P<0.01)。

    2.3 各組HepG2細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

    與BSA實驗組比較,ajugol組HepG2細(xì)胞中PPARα,p62和ATG7 mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05);與BSA + ajugol實驗組相比, palmitate + ajugol實驗組中的PPARα,p62和ATG7 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)。

    3 討論

    本研究致力于在細(xì)胞水平上探討中藥中的有效成分益母草苷對NAFLD的治療作用及其機制。通過HepG2細(xì)胞造模, 模擬出NAFLD的細(xì)胞模型, 從油紅O染色的結(jié)果可以看出, 益母草苷可顯著降低細(xì)胞模型中脂滴含量。同時, 通過LC3B的免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn),改善脂質(zhì)沉積的機制與自噬有一定的相關(guān)性。本實驗對自噬的相關(guān)基因P62和ATG7進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)益母草苷能較明顯的增強自噬基因的表達(dá),并且益母草苷促進(jìn)PPARα基因的表達(dá),提示益母草苷能減少脂質(zhì)在HepG2細(xì)胞體內(nèi)的蓄積。因此,推測益母草苷通過誘導(dǎo)自噬減少脂質(zhì)在機體內(nèi)的蓄積。

    綜上所述,益母草苷在增強細(xì)胞的自噬水平的同時,減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,說明益母草苷可能通過增強非酒精性脂肪肝細(xì)胞的自噬水平降低非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型脂質(zhì)沉積生, 因此可能對非酒精性脂肪肝具有一定的治療效果。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Yoomi, Chun, Joungmok et al. Autophagy: An Essential Degradation Program for Cellular Homeostasis and Life [J]. Cells, 2018.

    [2]Zhang R X, Li M X, Jia Z P. Rehmannia glutinosa: review of botany, chemistry and pharmacology [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 117(2):199-214.

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