二甲雙胍通過(guò)mTOR 信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬減輕心肌梗死小鼠心肌損傷

徐志成，張久旭，張景智，孫騰飛，姜曉華，宋春霞

缺血性心臟病嚴(yán)重威脅著人類健康，其中冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的心肌梗死（myocardial infarction，MI）造成心肌細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)壞死。 近年來(lái)，隨著心血管介入技術(shù)的不斷發(fā)展，大大增加了患者心梗后的存活率，而梗死后并發(fā)癥導(dǎo)致的心功能下降卻越來(lái)越普遍[1］。 如何進(jìn)一步減輕心梗后心肌損傷、改善心功能成為心臟康復(fù)研究的重要領(lǐng)域。 既往研究表明心梗損傷機(jī)制與炎癥刺激、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等相關(guān)，最新研究表明心肌細(xì)胞的mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬在MI 后心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[2-6］。二甲雙胍（metformin，Met）以往在臨床上作為降糖藥用于治療2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），近年來(lái)不斷有文獻(xiàn)報(bào)道其多樣性應(yīng)用研究，研究發(fā)現(xiàn)缺血性心臟病、糖尿病伴心力衰竭的患者使用二甲雙胍安全有效[7-9］。 Met 通過(guò)信號(hào)分子的調(diào)控改善心肌功能、發(fā)揮心臟保護(hù)作用的研究也越來(lái)越多[10-12］。 本實(shí)驗(yàn)在小鼠MI 模型中發(fā)現(xiàn)，Met可以通過(guò)調(diào)節(jié)Akt／mTOR 信號(hào)通路來(lái)下調(diào)自噬水平減輕MI 后心肌損傷，從而為Met 用于MI 的臨床應(yīng)用積累更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備及材料 激光共聚焦顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司，日本），Western blot 電泳設(shè)備（Bio-Rad 公司，美國(guó)）。 C57BL／6 小鼠（健康，雄性，8 周齡）80 只，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。 Met（Sigma 公司，美國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、mTOR、磷酸化mTOR （mammalian target of rapamycin， 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白） 、p62、LC3B 和Beclin1（Abcom 公司，美國(guó)），TUNEL 試劑盒購(gòu)（Roche公司），肌酸激酶同工酶（creatine kinase， CKMB）試劑盒（R＆D 公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠MI 模型建立 異氟烷麻醉后，固定（仰臥位），連接心電圖電極，記錄心電圖。 開胸暴露后，在小鼠心臟左心耳下方2 ～3 mm 處以6-0 號(hào)線結(jié)扎。 心電圖II 導(dǎo)聯(lián)ST 段抬高，結(jié)扎線下心肌缺血，模型建立成功。 假手術(shù)組僅開胸暴露。 所有小鼠隨機(jī)分4 組，即假手術(shù)組（Sham 組）、單純二甲雙胍[300 mg／（kg·d）］處理組（Met 組）、MI 組和Met[300 mg／（kg·d）］干預(yù)MI 組（Met+MI 組）。 Met組和Met+MI 組小鼠手術(shù)后以灌胃方式給予Met[300 mg／（kg·d）］至術(shù)后1月，Sham 組和MI 組手術(shù)后不做任何干預(yù)，記錄并計(jì)算各組小鼠死亡率，繪制生存曲線。

1.2.1 HE 染色 MI 建立1月后，迅速剪下心臟，冷PBS 緩沖液沖洗， 40 g／L 多聚甲醛固定72 h，石蠟包埋、切片及染色。

1.2.3 CKMB 檢測(cè) MI 建立后3 d，異氟烷麻醉，快速取小鼠頸動(dòng)脈血至4 ml EP 管中，4℃低溫靜置8 h 后，3000 r／min 離心15 min，取上清即為血清。 嚴(yán)格按照CKMB 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組血清中CKMB的含量，結(jié)果以U／L 為單位表示。

1.2.4 TUNEL 染色 切取小鼠左室前壁組織，石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水，按TUNEL 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)，采集圖像。 每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index， AI），凋亡細(xì)胞核為綠色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色。 AI ＝（凋亡細(xì)胞核數(shù)／總細(xì)胞核數(shù)）×100%。

1.2.5 LC3B 免疫熒光染色 切取小鼠左室前壁組織，石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水，用PBS 緩沖溶液洗5 次（3 min／次），Triton-X100（2 g／L）處理15 min，PBS 液沖洗5 次（3 min／次），山羊血清室溫封閉1.5 h，PBS 液洗5 次（3 min／次），每個(gè)切片加LC3B 抗體（1 ∶100）50 μl，4 ℃孵育15 h， PBS 液洗5 次（3 min／次），暗室內(nèi)每張切片加熒光二抗（1 ∶500） 50 μl，PBS 液洗5 次（3 min／次），避光條件下每張切片加DAPI 溶液50 μl，PBS 液洗5 次（ 3 min／次），用熒光防淬滅液封片，采集圖像。

1.2.6 Western-blot 檢測(cè) 切取小鼠左心室前壁組織50 mg，加入裂解液后低溫研磨裂解30 min，離心20 min（4 ℃，12000 g），取上清，定量采用BCA 比色法。 分別配置80 ml／L、100 ml／L 和120 ml／L 的分離膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，牛奶常溫封閉2 h，切下目的條帶，放入相應(yīng)的mTOR（1 ∶1000）、pmTOR（1 ∶1000）、Beclin1（1 ∶1000）、p62（1 ∶1000）和GAPDH（1 ∶5000）一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜，再用TBST 溶液洗膜5 次（3 min／次），二抗常溫孵育2 h，TBST 洗膜5 次（3 min／次），以GAPDH 為內(nèi)參，發(fā)光液顯色，采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)小鼠生存分析曲線的影響 各組小鼠4 周后的生存率Kaplane-Meier 分析表明MI+Met 組比MI 組的死亡率明顯降低（P＜0.05），主要死亡原因與心梗后心力衰竭有關(guān)，見圖1。

圖1 各組小鼠生存分析曲線

2.1 血清CKMB 含量的變化 Sham 組與Met 組血清CKMB 水平比較沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）；與Sham 組相比，MI 組血清CKMB 水平明顯升高（P＜0.05）；Met+MI 組血清中CKMB 水平比MI 組顯著降低（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 血清中CKMB 的含量

2.3 心肌組織TUNEL 染色 Sham 組與Met+Sham 組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞核染色較少且無(wú)差異（P＞0.05）；，MI 組比Sham 組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞核染色數(shù)量明顯增多（P＜0.05）；與MI 組相比，Met+MI 組可明顯減少TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞核染色數(shù)量（P＜0.05）。 見圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織TUNEL 染色和凋亡率

2.4 各組小鼠心肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Sham 組與Met 組自噬相關(guān)蛋白的含量無(wú)差異（P＞0.05）；MI 組比Sham 組p-mTOR 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），Beclin1、p62 含量顯著增高（P＜0.05）；MI+Met 組比MI 組的p-mTOR 的含量顯著升高（P＜0.05），Beclin1、p62 含量顯著顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

2.5 心肌LC3B 表達(dá)的免疫熒光染色 與Sham 組相比，Met 組LC3B 蛋白免疫熒光染色無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與Sham 組相比，MI 組LC3B 蛋白免疫熒光染色數(shù)量明顯增多（P＜0.05）；與MI 組相比， MI+Met 組LC3B 蛋白染色的數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖5。

圖4 各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

圖4 小鼠心肌組織LC3B 免疫熒光染色

3 討 論

急性MI 是常見的心血管急危重癥，起病較為隱襲，且具有高死亡率，目前多數(shù)入院患者行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)（percutaneous coronary stent implantatio，PCI）后，癥狀能夠明顯緩解，術(shù)后心功能明顯改善。 然而，MI 后的心肌損傷造成心功能下降，限制PCI 術(shù)后的效果[13］。 本研究建立小鼠MI 模型，探究MI 損傷相關(guān)指標(biāo)和自噬相關(guān)指標(biāo)變化，結(jié)果提示，MI 組心肌損傷加重、mTOR 的磷酸化表達(dá)被明顯抑制，并伴有自噬增強(qiáng)。 給予Met 處理后，心肌損傷明顯減輕、mTOR 的磷酸化表達(dá)增強(qiáng)，且伴有自噬降低。 上述結(jié)果提示，MI 損傷中，由mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬發(fā)揮重要作用。 本實(shí)驗(yàn)中，Met通過(guò)激活mTOR 信號(hào)通路、降低自噬，從而減輕MI造成的心肌損傷。

正常生理狀態(tài)下，自噬的作用是清除受損細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)[14］。 mTOR 作為PI3K 相關(guān)激酶家族成員及PI3K／Akt 信號(hào)通路下游分子，參與多種生物學(xué)過(guò)程，是自噬的調(diào)控中的關(guān)鍵分子，且與自噬過(guò)程呈負(fù)相關(guān)，mTOR 根據(jù)與其結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體的不同主要分為mTORC1 與mTORC2， 前者主要調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝及蛋白合成。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在小鼠MI模型中，p-mTOR 表達(dá)降低，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B 表達(dá)增加，p62 表達(dá)降低；而mTOR 被激活即p-mTOR 表達(dá)增高時(shí)，自噬相關(guān)蛋白Beclin1 和LC3B 表達(dá)減少，p62 表達(dá)增加，提示mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)自噬與小鼠MI 模型心肌損傷密切相關(guān)。

Met 是治療T2DM 的重要降糖藥物，以往專家共識(shí)中明確指出：可以將Met 列入T2DM 患者的第一步治療中，即在單純飲食控制和體育鍛煉的同時(shí)接受Met 治療[1］。 近年來(lái)，關(guān)于Met 的研究不斷拓展到其他領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)能夠抑制T2DM 患者消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)腫瘤的進(jìn)程并改善預(yù)后，同時(shí)對(duì)于腫瘤治療，還可以增強(qiáng)化療療效，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。 Met 可以有效降低糖尿病相關(guān)心臟疾病風(fēng)險(xiǎn)，其心血管保護(hù)機(jī)制降糖、代謝改變以及細(xì)胞功能改善等相關(guān)[15-18］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Met 在減輕心血管損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制可能與自噬過(guò)程密切相關(guān)。 Met 可明顯改善MI 后心肌纖維化程度及心肌細(xì)胞凋亡，減少血清中梗死標(biāo)志物CKMB的含量，結(jié)果證實(shí)了Met 減輕MI 損傷的作用；同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)，Met 組自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與Sham 組均無(wú)明顯變化；與Sham 組相比，MI 組p-mTOR 表達(dá)明顯降低，LC3B 和Beclin1 的表達(dá)顯著升高，p62表達(dá)降低；MI+Met 組p-mTOR 的表達(dá)比MI 組明顯增高，自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1 的表達(dá)顯著降低，p62 表達(dá)升高，表明Met 可以激活mTOR 信號(hào)降低自噬改善MI 損傷。 初步認(rèn)為MI 心肌缺血抑制mTOR 信號(hào)通路的激活；Met 通過(guò)激活mTOR 信號(hào)通路下調(diào)自噬水平減輕MI 損傷。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，本研究已經(jīng)證實(shí)Met通過(guò)激活mTOR 信號(hào)通路下調(diào)自噬減輕MI 損傷，為Met 在MI 中發(fā)揮保護(hù)作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，Met 激活mTOR 信號(hào)通路向下調(diào)MI 自噬具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。