351株甲真菌病病原菌臨床分布及體外藥敏試驗

鄭文愛，喬 鳳，唐小正，吳偉偉

(海南省第五人民醫(yī)院 1. 檢驗科；2. 皮膚科，海南 ?？?570206)

甲癬通常指皮膚癬菌感染指甲或趾甲所引起的疾病。甲真菌病是一個用于描述甲真菌感染性疾病的非特定術(shù)語，除了皮膚癬菌感染外，還可由一部分的霉菌和假絲酵母菌感染引起。甲真菌病影響美觀，病情嚴(yán)重可以影響生活質(zhì)量。強(qiáng)效、安全的口服及外用抗真菌藥物的問世，給甲真菌病的治療帶來了顯著的效果。甲真菌病的臨床診療仍缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療原則，存在診斷不清、盲目選擇口服藥物等問題，導(dǎo)致治療效果不理想。故本研究收集海南省各地區(qū)甲真菌病患者的甲屑標(biāo)本，對培養(yǎng)出的真菌菌株進(jìn)行分析和體外藥敏試驗，以便了解海南省2016—2018年甲真菌病病原菌的分布以及菌株對臨床常用抗真菌藥物的敏感性，為臨床的診療提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共收集2016年5月—2018年11月某院就診的具有典型甲真菌病臨床表現(xiàn)及真菌直接鏡檢陽性的患者348例，其中男性138例，女性210例；年齡為1～82歲，平均年齡為(33.91±6.03)歲；病程1個月～15年，平均病程為(4.24±3.20)年。

1.2 材料與方法

1.2.1 材料 主要材料包括含氯霉素(50 mg/L)的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，江門凱創(chuàng)公司生產(chǎn))、馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA，自配)[1]、尿素培養(yǎng)基(自配)[1]、酵母菌(YST)鑒定卡(法國梅里埃公司生產(chǎn))、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(SAP，迪景公司生產(chǎn))，主要儀器包括生物顯微鏡(型號:CX21，OLYMPUS公司生產(chǎn))、生物安全柜(型號: BSC-1300IIA2，北京聯(lián)合科儀科技有限公司生產(chǎn))、電恒溫培養(yǎng)箱(型號: YS-138C，福意聯(lián)公司生產(chǎn))。

1.2.2 方法

1.2.2.1 取材 75%乙醇消毒病甲及周圍皮膚，用滅菌手術(shù)刀輕輕刮取病甲屑置于滅菌玻片上。將取得的甲屑均分為二，一份加10%KOH(氫氧化鉀)后蓋上蓋玻片鏡檢，一份用于真菌培養(yǎng)。

1.2.2.2 真菌培養(yǎng) 采用三點(diǎn)接種法將樣本接種在兩管SDA中，置入25～28℃電恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～4周，每隔3 d觀察1次，如每管斜面培養(yǎng)基中2個點(diǎn)或3個點(diǎn)有同1種真菌生長即鑒定為病原菌。

1.2.2.3 菌種鑒定 根據(jù)菌落生長速度快慢、菌落的形態(tài)特征和顏色變化進(jìn)行鑒定，盡量鑒定到種。若生長出絲狀毛癬菌落即可接種到尿素培養(yǎng)基和PDA，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色變化進(jìn)行初步鑒定；同時做銅圈法小培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察小培養(yǎng)生長情況，根據(jù)鏡下大、小分生孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，判斷毛癬菌種類。生長出酵母菌落即可接種到SAP觀察顏色變化，同時分離轉(zhuǎn)種菌落，取單個菌落上鑒定卡鑒定菌種。白假絲酵母菌鑒定必要時加做血清芽管試驗。疑難的菌種轉(zhuǎn)種PDA，培養(yǎng)7 d后，送公司進(jìn)行測序。

1.2.2.4 藥敏試驗 甄選98株經(jīng)測序后的菌株進(jìn)行藥敏試驗，其中絲狀真菌44株，包括紅色毛癬菌23株、指(趾)間毛癬菌5株、茄病鐮刀菌12株、威尼克何德霉4株，假絲酵母菌54株，包括白假絲酵母菌16株、近平滑假絲酵母菌21株、熱帶假絲酵母菌13株、都柏林假絲酵母菌4株。藥物選用本地區(qū)常用抗絲狀真菌藥物(特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑和氟康唑)和抗假絲酵母菌藥物(伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑和酮康唑)。藥敏試驗方法采用液基稀釋法，最小抑菌濃度(MIC)值采用點(diǎn)判讀法進(jìn)行結(jié)果判讀。特比萘芬MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)為與生長對照相比較，無任何肉眼可辨生長(100%)的最低藥物濃度；唑類藥物(伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑和酮康唑)MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)為與生長對照進(jìn)行比較，生長明顯抑制(80%)的最低藥物濃度。同時重復(fù)檢測2孔，2孔結(jié)果必須一致才能判為MIC值。對所有試驗菌株記錄藥物MIC值，計算MIC范圍、MIC幾何均數(shù)；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株為近平滑假絲酵母菌(ATCC22019)。具體操作參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會2008年版絲狀菌藥敏試驗方案M38-A2(CLSI-M38-A2)[2]和美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會2008年版酵母菌藥敏試驗方案M27-A3(CLSI-M27-A3)[3]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共收集348例甲真菌病患者，其中345例患者分離出單一的病原菌，3例患者分離兩種病原菌，共分離351株病原菌，其中1例患者分離紅色毛癬菌和光滑假絲酵母菌，1例患者分離熱帶假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌，1例患者分離茄病鐮刀菌和近平滑假絲酵母菌。348例患者來自海南省各個市縣，其中以北部地區(qū)(?？谑?、澄邁縣)居多，共305例；其次是南部地區(qū)(三亞市、樂東縣、東方市、三沙市)16例，中部地區(qū)(瓊中縣、五指山市、屯昌市)11例，西部地區(qū)(儋州市、臨高縣、昌江市、白沙縣)10例，東部地區(qū)(文昌市、瓊海市、萬寧市、陵水市)6例。

2.2 病原菌的構(gòu)成 351株病原菌以酵母樣菌屬為主(53.28%)，其中優(yōu)勢菌為近平滑假絲酵母菌(22.22%)和白假絲酵母菌(11.40%)；其次是皮膚癬菌屬(29.63%)，其中優(yōu)勢菌為紅色毛癬菌(25.07%)。女性與男性患者分別檢出病原菌216、135株。見表1。

表1 不同性別甲真菌病患者分離真菌分布

2.3 各年齡段患兒病原菌的分布 檢出病原菌的患者年齡段主要集中在21～30歲(86株)、31～40歲(77株)、41～50歲(49株)。見表2。

表2 各年齡段不同性別甲真菌病患者病原真菌分布情況(株)

2.4 臨床分型 甲真菌病患者臨床分型主要為以遠(yuǎn)端側(cè)緣甲下型(47.41%)、淺表白甲型(18.97%)、全甲破壞型(15.80%)為主。348例甲真菌病中有181例來自于指甲，167例來自于趾甲，指甲與趾甲比是1∶1.08。見表3。

表3 不同性別的甲真菌病患者臨床分型分布(例)

2.5 藥敏結(jié)果 紅色毛癬菌和指(趾)間毛癬菌對特比萘芬的MIC幾何均數(shù)最低(分別為0.008、0.010 μg/mL)，茄病鐮刀菌對伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑的MIC幾何均數(shù)均較高(分別為3.793、11.016、57.018 μg/mL)，對伏立康唑MIC幾何均數(shù)最低(1.260 μg/mL)；假絲酵母菌(白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌)對酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑的MIC幾何均數(shù)均較低。見表4。

表4 常見抗真菌藥對甲真菌病病原真菌的MIC值(μg/mL)

3 討論

甲真菌病是成人最常見的甲病，占所有甲疾病的15%～40%。據(jù)統(tǒng)計英國成人甲真菌病發(fā)病率為3%，約1/3 的甲癬患者與足癬相關(guān)，且老年人和男性最容易發(fā)生甲真菌感染[4]。甲真菌病的病因有較廣泛的地域和種族差異，在英國85%～90%的甲真菌感染是由皮膚癬菌引起，5%由非皮膚癬菌性霉菌引起，最常見的病原菌是紅色毛癬菌和趾間毛癬菌，親動物性皮膚癬菌通常僅見于指甲感染中。甲癬易感性有其遺傳學(xué)基礎(chǔ)，家族性遠(yuǎn)端側(cè)緣甲真菌病由紅色毛癬菌感染引起，與家庭內(nèi)部間傳染無關(guān)[4]。

本研究中甲真菌病患者男女比例為1∶1.52，女性多于男性，尤其集中在21～30歲、31～40歲這兩個年齡段的中青年女性，與大多數(shù)中文文獻(xiàn)[4-7]報道的發(fā)病年齡相符；考慮原因可能為女性更注重儀表，穿著高跟鞋及做美甲等行為容易造成指/趾甲物理及化學(xué)性損傷，以及患病后求治心理更為迫切；且此年齡段的女性是家務(wù)勞動的主要人群，考慮在做家務(wù)時，存在可能長時間穿著不透氣防水鞋等因素。348例甲真菌病臨床分型以DLSO型最常見(占47.41%)，與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]報道一致，可能是由于甲的生理結(jié)構(gòu)使其前端和側(cè)緣容易受傷，或是遠(yuǎn)端和側(cè)緣易受到鞋子的擠壓從而引起損傷。 患甲中的指甲與趾甲比是1∶1.08，與本地報道[8]結(jié)果一致，可能與本地天氣潮濕炎熱、長期穿鞋襪、透氣性差等原因相關(guān)，導(dǎo)致趾甲易被真菌感染。

本研究中病原菌是以近平滑假絲酵母菌為優(yōu)勢菌的酵母菌屬為主，與相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]報道結(jié)果一致，不同于文獻(xiàn)[5-7，10-18]報道甲真菌病的首要病原菌為皮膚癬菌屬，可能與不同的地域、氣候環(huán)境、人群等因素相關(guān)。本研究結(jié)果顯示甲真菌病患者中近平滑假絲酵母菌(22.22%)比白假絲酵母菌(11.40%)所占比率高，而熱帶假絲酵母菌(6.27%)和光滑假絲酵母菌(1.71%)構(gòu)成比較低，此結(jié)果與筆者以往研究[8]結(jié)果相同，但與國內(nèi)幾次大規(guī)模的甲真菌病病原菌流行病學(xué)的多中心研究報道[10-13]和近年來專家們相關(guān)報道[7，14-18]結(jié)果不一致。說明海南地區(qū)引起甲真菌病的主要酵母菌屬不再是以往認(rèn)為的白假絲酵母菌，可能會隨著時間、地點(diǎn)的不同而發(fā)生改變。本研究顯示共分離毛孢子菌(阿薩希毛孢子菌、黏性絲孢酵母菌)25株(占7.12%)，但筆者以往的研究[8]中未發(fā)現(xiàn)有毛孢子菌，原因可能是與本次研究方法中部分形態(tài)學(xué)不能準(zhǔn)確鑒定的菌株，均采用分子測序方法，能準(zhǔn)確鑒定病原菌。本研究分離的病原菌其次為皮膚癬菌屬，只分離出紅色毛癬菌(25.07%)和指(趾)間毛癬菌(4.56%)，未分離出其他皮膚癬菌，主要致病皮膚癬菌種類與全國各地的報道[5-18]基本相同。霉菌屬中主要檢出黃曲霉和煙曲霉，與相關(guān)報道[5-15]結(jié)果基本相同。

本研究中分離出威尼克何德霉(1.14%)、對半新柱頂孢(0.86%)、橄欖小孢似盤多毛孢(0.28%)、木霉(0.28%)等熱帶和亞熱帶自然環(huán)境中存在的菌株，其中威尼克何德霉是熱帶、亞熱帶多見的掌黑癬病原菌，除了對半新柱頂孢在國內(nèi)外分離的病甲中已有相關(guān)報道[12-13]外，其余真菌目前國內(nèi)外未有分離自甲真菌病的報道。因此除皮膚癬菌屬外，酵母菌屬、霉菌屬和其他絲狀真菌三種分類的菌株也可能為污染菌或定植菌，臨床醫(yī)生在診治時應(yīng)充分結(jié)合臨床癥狀、病史和地域特殊性因素進(jìn)行分析。本次研究發(fā)現(xiàn)了3例患者分離出兩種病原菌，提示臨床醫(yī)生在診療過程中應(yīng)注意多重真菌感染。

分析98株真菌菌株的藥敏試驗，氟康唑?qū)Σ糠旨t色毛癬菌MIC值較高，說明該藥物可能不是紅色毛癬菌的最佳選擇,此結(jié)果與相關(guān)研究[18-19]結(jié)果相似。本地區(qū)皮膚癬菌引起的甲真菌病推薦首選特比萘芬、伊曲康唑，與英國以及中國甲真菌病診療指南[4，20]推薦方案一致。茄病鐮刀菌對伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑的MIC值較高，對伏立康唑的MIC值相對較低，說明可能前3種藥物不適用于茄病鐮刀菌引起的甲真菌病單物治療，可考慮藥物聯(lián)合治療方案。假絲酵母菌引起的甲真菌病可首選伏立康唑、酮康唑、伊曲康唑，尤其要注意克柔假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌對氟康唑天然不敏感。

由于甲真菌病患者直接鏡檢和真菌培養(yǎng)的陽性率均不高，且培養(yǎng)與藥敏試驗耗時較長，難以滿足臨床的實際需要。因此，臨床工作中很多皮膚科醫(yī)生在真菌培養(yǎng)和藥敏試驗結(jié)果出來之前即憑經(jīng)驗用藥。了解海南地區(qū)近兩年甲真菌病的臨床分型、病原菌的分布情況，以及分離到的主要菌株藥敏結(jié)果，對本地區(qū)甲真菌病的臨床診治具有重要的指導(dǎo)意義。