不同人群新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的臨床價(jià)值

胡亞會(huì)，鄭 陽(yáng)，李瑩瑩，陳 軍，孟婧潔，閆 琛，宋銀森

(鄭州人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，河南 鄭州 450015)

2019年12月以來(lái)，我國(guó)湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)一種以發(fā)熱、肺部感染為主要癥狀的傳染性疾病，隨后在全國(guó)各省市地區(qū)發(fā)現(xiàn)類似疾病。2020年1月7日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心從患者的咽拭子標(biāo)本中鑒定出一種新型冠狀病毒，最初被世界衛(wèi)生組織(WHO)命名為2019-nCoV[1-3]。1月30日，世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布新型冠狀病毒肺炎疫情構(gòu)成國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[4]。2月11日，WHO將這種疾病重命名為2019冠狀病毒病(COVID-19)，引起該疾病的病毒為新病原體，重新命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。目前，COVID-19呈現(xiàn)出全球范圍內(nèi)流行趨勢(shì)，截至4月1日10時(shí)，我國(guó)確診病例82 617例，境外輸入病例771例；除我國(guó)以外，全球已有200個(gè)國(guó)家和地區(qū)774 494例確診病例[5]。

SARS-CoV-2為β屬冠狀病毒，是單股正鏈RNA病毒，在此之前流行的人冠狀病毒主要有6種，分別為α-冠狀病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63，β-冠狀病毒的HCoVOC43、HCoV-HKU1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)。其中，SARS-CoV、MERS-CoV和 SARS-CoV-2均表現(xiàn)為嚴(yán)重的下呼吸道感染[6]。SARS-CoV-2可通過(guò)飛沫、接觸和氣溶膠傳播，與2003年流行的SARS-CoV相比，SARS-CoV-2致死率相對(duì)要低(4%)，但隱性感染者和輕癥病例較多，使得傳播更為廣泛[7-8]。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)和高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2基因均為確診COVID-19的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，高通量測(cè)序耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、對(duì)檢測(cè)人員和儀器要求高，不能滿足大規(guī)模標(biāo)本檢測(cè)的臨床需求。RT-PCR病毒核酸檢測(cè)具有簡(jiǎn)便快速、特異性高、成本較低、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于臨床[9]。本文采用RT-PCR方法對(duì)發(fā)熱門診、隔離病區(qū)患者、本院一線疫情防控醫(yī)護(hù)人員、未出現(xiàn)COVID-19癥狀的住院患者、陪護(hù)家屬和大范圍篩查復(fù)工前體檢人群進(jìn)行檢測(cè)，為臨床SARS-CoV-2核酸檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)室參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2020年2月1日—3月22日鄭州人民醫(yī)院(河南省鄭州市COVID-19定點(diǎn)檢測(cè)和收治醫(yī)院)發(fā)熱門診、隔離病房疑似和確診COVID-19患者(共2 685例)的咽拭子標(biāo)本，同時(shí)采集本院疫情防控一線醫(yī)護(hù)人員、所有未出現(xiàn)COVID-19癥狀的住院患者、陪護(hù)家屬和復(fù)工體檢人員的咽拭子標(biāo)本。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器 采用兩種試劑盒對(duì)發(fā)熱門診和隔離病房檢出的所有陽(yáng)性標(biāo)本和確診COVID-19患者治療后復(fù)查標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分為A組和B組，其余送檢標(biāo)本只用其中一種檢測(cè)試劑盒。A組采用上海之江生物新型冠狀病毒核酸快速檢測(cè)試劑盒(RT-PCR)，病毒RNA提取采用EX3600核酸提取儀(上海之江生物)。B組采用湖南圣湘生物新型冠狀病毒核酸快速檢測(cè)試劑盒，不需提取病毒RNA直接按照說(shuō)明書配制反應(yīng)體系并擴(kuò)增產(chǎn)物。兩組均采用美國(guó)Thermo Fisher Scientific ABI7500型熒光定量PCR儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.2 檢測(cè)方法 所有標(biāo)本先56℃滅活30 min預(yù)處理后再進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。A組需提取病毒RNA，嚴(yán)格按照之江試劑說(shuō)明書進(jìn)行提取，標(biāo)本混勻后，吸取300 μL標(biāo)本(咽拭子病毒保存液或血清標(biāo)本)采用磁珠法獲得50 μL的病毒總RNA溶液。按照兩種廠家試劑說(shuō)明書設(shè)置反應(yīng)程序，A組檢測(cè)SARS-CoV-2開放讀碼框1ab(open reading frame, ORF1ab)、核殼蛋白(nucleoprotein, N)基因和包膜蛋白(envelope protein, E)基因三個(gè)位點(diǎn)，B組檢測(cè)SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因兩個(gè)位點(diǎn)。

1.2.3 結(jié)果判讀 兩組檢測(cè)試劑均含內(nèi)源性監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(內(nèi)標(biāo)，IC)，用于監(jiān)控核酸提取及擴(kuò)增過(guò)程，每次試驗(yàn)均設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果分析時(shí)首先查看內(nèi)標(biāo)通道是否有擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)是否達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)，同時(shí)檢查質(zhì)控品結(jié)果是否合格。以上要求均滿足說(shuō)明試驗(yàn)有效，如果有一條不滿足則為無(wú)效需重新檢測(cè)。A試劑PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果判定為陽(yáng)性(Ct值≤43，典型S擴(kuò)增曲線)，陰性(Ct值>43或無(wú)擴(kuò)增曲線)；B試劑PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果判定為陽(yáng)性(Ct值≤40，典型S擴(kuò)增曲線)，陰性(Ct值>40或無(wú)擴(kuò)增曲線)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 易感人群及大范圍篩查結(jié)果 共檢測(cè)本院一線疫情防控醫(yī)護(hù)人員、所有未出現(xiàn)COVID-19癥狀的住院患者、陪護(hù)家屬和復(fù)工體檢人員咽拭子標(biāo)本12 812份，所有標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)均為陰性。見表1。

表1 易感人群及大范圍篩查人員咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果(份)

2.2 發(fā)熱門診患者和隔離病房患者核酸檢測(cè)結(jié)果 共檢測(cè)發(fā)熱門診、隔離病房患者2 685份咽拭子標(biāo)本，其中核酸陽(yáng)性24份(0.89%)，陰性2 661份(99.11%)；24例咽拭子SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性患者同時(shí)送檢的血標(biāo)本，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果呈陰性。咽拭子SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性患者中年齡12～86歲，中位數(shù)為47歲；男性患者13例(54.17%)，女性患者11例(45.83%)。見表2。

表2 發(fā)熱門診、隔離病房患者咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果[例(%)]

2.3 兩組試劑盒首次核酸檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果 24例SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性咽拭子標(biāo)本，兩組試劑首次核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性。A組試劑病毒 ORF1ab基因、N基因和E基因三個(gè)位點(diǎn)均呈典型S擴(kuò)增曲線，B組試劑病毒 ORF1ab基因無(wú)擴(kuò)增曲線、N基因呈典型S擴(kuò)增曲線。見圖1。

A為之江試劑，B為圣湘試劑。

2.4 兩組試劑復(fù)查核酸檢測(cè)結(jié)果 24例確診COVID-19患者治療后復(fù)查SARS-CoV-2核酸時(shí)，2例患者咽拭子標(biāo)本A組試劑檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，且SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因和E基因三個(gè)位點(diǎn)均呈S擴(kuò)增曲線，B組試劑檢測(cè)結(jié)果均為陰性(見圖2、3)；其余22例患者咽拭子標(biāo)本兩組試劑檢測(cè)結(jié)果一致。

A為之江試劑，B為圣湘試劑。

A為之江試劑，B為圣湘試劑。

3 討論

根據(jù)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)專家共識(shí)要求，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)應(yīng)在經(jīng)過(guò)嚴(yán)格生物安全評(píng)估的二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，檢測(cè)人員均執(zhí)行三級(jí)生物安全防護(hù)[10]。采集咽拭子方法為在咽峽深部(懸雍垂及扁桃體兩側(cè))利用植絨拭子反復(fù)刮取，采集后立即將拭子頭浸入含3 mL的病毒保存液管[11]。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸很少出現(xiàn)徦陽(yáng)性，但是陽(yáng)性患者的陽(yáng)性率相對(duì)較低(30%～50%)，所以疑似病例需經(jīng)過(guò)多次核酸檢測(cè)提高陽(yáng)性率。本研究結(jié)果顯示，發(fā)熱門診、隔離病房患者SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性率為0.89%，與海南三亞某醫(yī)院的陽(yáng)性率相當(dāng)[12]。核酸檢測(cè)結(jié)果容易出現(xiàn)假陰性，除了試劑影響因素外，可能還與病毒本身的變異、采集樣本時(shí)間、標(biāo)本質(zhì)量、檢測(cè)人員操作水平、儀器設(shè)備等因素有關(guān)[13]。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)的特異性和敏感性均較高，可用于各種類型生物標(biāo)本的檢測(cè)，如痰、呼吸道分泌物、血、尿和糞便等，對(duì)疾病早期診斷和治療效果監(jiān)測(cè)具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值，尤其對(duì)于無(wú)癥狀感染者的早期發(fā)現(xiàn)更為重要[14]。對(duì)所有本院一線疫情防控醫(yī)護(hù)人員、未出現(xiàn)COVID-19癥狀的住院患者、陪護(hù)家屬等易感人群進(jìn)行篩查，可以防范醫(yī)患、陪護(hù)和探視人員之間的交叉感染，有利于全院疫情防控工作的順利進(jìn)行[15]。目前，全國(guó)范圍工業(yè)企業(yè)平均復(fù)工率約為98.6%，復(fù)工人員進(jìn)行SARS-CoV-2核酸篩查，可大幅度縮短醫(yī)學(xué)觀察時(shí)間，保障復(fù)工復(fù)產(chǎn)過(guò)程中的疫情防控需要。

本研究SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性標(biāo)本均來(lái)自于咽拭子，24例咽拭子檢測(cè)核酸陽(yáng)性患者，其同時(shí)送檢的血標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)均為陰性，與施紹瑞等[16]研究結(jié)果一致?？赡茉?yàn)椋?1)所有確診病例均為輕型和普通型，未發(fā)現(xiàn)重型/危重型病例，不能代表所有類型確診患者的檢測(cè)結(jié)果；(2)納入的確診患者病例數(shù)相對(duì)較少，樣本量有限。本研究24例確診COVID-19患者男女性別比為1.18∶1，對(duì)全國(guó)72 314例確診COVID-19病例研究發(fā)現(xiàn)男女比例為1.06∶1[17]，上海市某三甲醫(yī)院14例COVID-19確診患者的男女比例為1.33∶1[18]，基于以上數(shù)據(jù)推測(cè)可能樣本量越大男女比例越接近1∶1。本研究發(fā)現(xiàn)，確診COVID-19患者年齡中位數(shù)為47歲，62.50%的患者年齡集中在20～60歲，與相關(guān)文獻(xiàn)[12,17-18]研究結(jié)果雖有所差異，但均提示年齡與COVID-19的感染相關(guān)，中老年人群更易感染。

目前，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒中大多數(shù)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，且均采用Taqman探針[19]。本研究比較了兩種國(guó)產(chǎn)試劑盒核酸檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種試劑對(duì)陽(yáng)性咽拭子標(biāo)本核酸檢測(cè)能力差別不大，但A試劑檢測(cè)病毒ORF1ab、N和E三個(gè)基因位點(diǎn)，B試劑只能檢出病毒N基因位點(diǎn)。對(duì)COVID-19患者治療后復(fù)查SARS-CoV-2核酸結(jié)果Ct值接近陽(yáng)性臨界值的咽拭子標(biāo)本，A試劑的檢測(cè)能力要優(yōu)于B試劑。分析原因可能是：(1)由于此次疫情屬于突發(fā)公共衛(wèi)生事件，試劑盒在研發(fā)過(guò)程中尚無(wú)足夠的臨床標(biāo)本和時(shí)間進(jìn)行完整的性能驗(yàn)證，尤其是對(duì)于檢出限和灰區(qū)的臨床驗(yàn)證，各廠家核酸檢測(cè)試劑盒質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性需要不斷優(yōu)化；(2)由于本研究納入的確診患者病例數(shù)較少，樣本量有限，并不能代表2種試劑的整體檢測(cè)性能[20]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)與首檢咽拭子標(biāo)本的Ct值相比，24例確診COVID-19患者經(jīng)治療后復(fù)檢咽拭子樣本的Ct值，大多數(shù)有所下降，表明隨著臨床癥狀的緩解，病毒載量在患者體內(nèi)亦有所下降。當(dāng)臨床癥狀完全消失，連續(xù)兩次復(fù)檢咽拭子SARS-CoV-2核酸陰性，可作為臨床治愈出院標(biāo)準(zhǔn)。目前，在本院治療的24例確診COVID-19患者中，初診均為輕型和普通型；其中23例從入院開始病情逐漸好轉(zhuǎn)直至治愈出院，1例初診輕型患者治療1周后病情加重轉(zhuǎn)為重型，改變方案繼續(xù)進(jìn)一步治療后治愈出院。后續(xù)將持續(xù)進(jìn)行出院患者的追蹤隨訪，健康指標(biāo)監(jiān)測(cè)，以便進(jìn)一步認(rèn)識(shí)COVID-19。

本研究對(duì)發(fā)熱門診和隔離病房患者、易感人群以及大規(guī)模篩查人群進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)對(duì)于COVID-19患者的臨床診療和控制疫情進(jìn)展有非常重要的價(jià)值。分析兩個(gè)部位生物標(biāo)本的核酸檢出陽(yáng)性率和兩種不同廠家試劑的檢測(cè)能力，為SARS-CoV-2實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)提供參考依據(jù)。本研究的局限性在于未對(duì)24例確診COVID-19病例做臨床和流行病學(xué)特征分析，不能為制定疫情防控策略和措施提供科學(xué)依據(jù)，下一步將重點(diǎn)分析確診COVID-19病例的臨床和流行病學(xué)特征。