基于凋亡和自噬途徑的石榴皮多酚對人前列腺癌PC3細(xì)胞的抑制作用機(jī)制研究

馮甜 劉盟 程路峰 高曉黎 楊曉君

摘 要 目的：基于自噬和凋亡途徑研究石榴皮多酚（PPP）對人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖的抑制作用機(jī)制。方法：采用CCK-8法考察不同質(zhì)量濃度PPP（25～300 μg/mL）作用24、48、72 h對PC3細(xì)胞活性的影響，篩選給藥濃度和作用時間。將PC3細(xì)胞分為對照組（完全培養(yǎng)基）和PPP低、中、高質(zhì)量濃度組，培養(yǎng)48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)和Annexin V-FITC/PI染色法分別檢測細(xì)胞周期分布和凋亡情況，采用Western blotting法檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白 LC3、Beclin-1、p62、Atg12、Atg16的表達(dá)水平。結(jié)果：選擇48 h為培養(yǎng)時間，PPP的半數(shù)抑制濃度為110 μg/mL，選擇50、100、200 μg/mL為低、中、高質(zhì)量濃度。與對照組比較，PPP低、中質(zhì)量濃度組G0/G1期細(xì)胞百分比均顯著降低而S期細(xì)胞百分比均顯著升高，PPP高質(zhì)量濃度組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著升高，PPP中、高質(zhì)量濃度組G2/M期細(xì)胞百分比均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;PPP各質(zhì)量濃度組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與對照組比較，PPP各質(zhì)量濃度組的抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白p62表達(dá)水平均有不同程度的下降，促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1、Atg5、Atg12和Atg16的表達(dá)水平均有不同程度的上升，且PPP高質(zhì)量濃度組上述指標(biāo)以及低、中質(zhì)量濃度組上述部分指標(biāo)組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：PPP能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 石榴皮多酚;前列腺癌;PC3細(xì)胞;凋亡;自噬;機(jī)制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the inhibitory mechanism of pomegranate peel polyphenols（PPP） on the proliferation of? human prostate cancer PC3 cells based on autophagy and apoptosis pathway.? METHODS： CCK-8 assay was used to investigate the effects of PPP with different concentrations（25-300 μg/mL） on PC3 cell activity after culturing for 24，48，72 h， so as to screen the drug concentration and treatment time. PC3 cells were divided into control group （complete culture medium）， PPP low-， medium- and high-concentration groups. After treated for 48 h， flow cytometry and Annexin V-FITC/PI staining were used to detect cell cycle distribution and apoptosis of PC3 cells. Western blotting assay was used to detect the expression of apoptosis-related protein as Bax， Bcl-2， as well as the expression of autophagy-related proteins as LC3，Beclin-1，p62，Atg12 and Atg16. RESULTS： The culturing time was chosen as 48 h. IC50 of PPP was 110 μg/mL， and 50， 100， 200 μg/mL were chosen as low， medium， high concentrations of PPP. Compared with control group， the percentage of PC3 cells at phase G0/G1 decreased significantly in PPP low- and medium-concentration groups while increased significantly at phase S; that of PC3 cells at phase G0/G1 increased significantly in PPP high-concentration group; while that of PC3 cells at phase G2/M decreased significantly in PPP medium- and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）. The apoptosis rate of PC3 cells was increased significantly in PPP groups （P<0.05 or P<0.01）. Compared with control group， protein expression of anti-apoptosis protein Bcl-2 and autophagy-related promoting protein p62 were decreased in PPP groups to different extents， while protein expression of promoting-apoptosis protein Bax as wells as autophagy-related protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ration and protein expression of Beclin-1， Atg5， Atg12 and Atg16 were increased to different extents; there was statistical significance in above indexes in PPP high-concentration group and some of above indexes in PPP low- and medium-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： PPP can inhibit the proliferation of human prostate cancer PC3 cells， mechanism of which may be related to inducing autophagy and promoting apoptosis.

KEYWORDS? ?Pomegranate peel polyphenols;Prostate cancer;PC3 cell; Apoptosis; Autophagy; Mechanism

前列腺癌是中老年男性常見的惡性腫瘤，其在我國的發(fā)病率也逐漸上升，至今還是臨床難以攻克的疑難之癥[1-2]，因此探索更加高效便捷的治療方法具有重要意義。有研究表明，前列腺癌的發(fā)展與自噬有密切關(guān)系[3]。自噬是細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器進(jìn)入囊泡，與溶酶體形成自噬溶酶體并降解其包裹的內(nèi)容物的過程，以此可更新細(xì)胞器并完成細(xì)胞的自身代謝[4]。適度自噬能讓靶細(xì)胞對外界損傷作出反應(yīng)，使其存活，同時也能夠?qū)⑹軗p的細(xì)胞器清除干凈，有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[5]。在前列腺癌的治療過程中，化療藥物能夠激活腫瘤細(xì)胞自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6];自噬也能通過對受損細(xì)胞器的降解和再利用來保護(hù)細(xì)胞器和細(xì)胞成分免受損傷[7]，因此自噬作用可能具有重要的臨床價值。

研究表明，石榴科石榴屬植物石榴（Punica granatum L.）的果汁和果皮提取物均能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞系的增殖、遷移和集落形成，且果皮提取物比果汁的效果更優(yōu)[8]。為了探討石榴果皮有效部位的抗腫瘤活性，本課題組開展了前期研究工作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚（Pomegranate peel polyphenols，PPP）對PC3細(xì)胞具有一定的抑制作用，并可促進(jìn)其凋亡，表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性[9-11]?；诖?，本文將基于自噬與凋亡途徑研究PPP對人前列腺癌PC3細(xì)胞的抑制作用機(jī)制，為闡明PPP治療前列腺癌的藥效機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

HERAcell 150i型CO2恒溫培養(yǎng)箱、KS12型生物安全柜、iBright FL1000型凝膠制備成像系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ME54E型分析天平（上海升亮電子科技有限公司）;4K1S型高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）;SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）;LSR Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）;Mini-Protean 1658001型電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

PPP[新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制，批號：20171224，含量：82.7%（采用高效液相色譜法測定，以安石榴苷計）[12]]由新疆醫(yī)科大學(xué)藥劑教研室常占瑛實驗師提供。

RPMI 1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、胰蛋白酶（美國Hyclone公司，批號：SH30809.01、SH30256.01B、J170041）;胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素雙抗（美國Gibco公司，批號：10099141、15140-122）;CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒（日本Dojindo公司，批號：KR675）;Annexin V/PI試劑盒（上海貝博生物科技公司，批號：BB-4101）;山羊抗兔Bax單克隆抗體、山羊抗兔Bcl-2單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：50599-2、12789-1）;山羊抗兔單克隆自噬抗體檢測試劑盒（包含多種自噬相關(guān)蛋白的一抗及二抗）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗、內(nèi)參GAPDH（美國CST公司，批號：4445T、7074P2、2118S）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：26616）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：23227）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人前列腺癌PC3細(xì)胞株由上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司提供（液氮中保存）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和溶液配制

取LC3細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，加入完全培養(yǎng)基（即含有10%FBS+1%青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基），混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同），6 h后觀察細(xì)胞鋪板狀態(tài)，次日換液。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

取PPP粉末，加水制成質(zhì)量濃度為800 μg/mL的PPP母液;臨用時，取該母液用完全培養(yǎng)基稀釋，制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的PPP藥液（現(xiàn)用現(xiàn)配），用于后續(xù)試驗。

2.2 PPP對PC3細(xì)胞增殖活性的影響考察

采用CCK-8法對細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的PC3細(xì)胞，計數(shù)后，用完全培養(yǎng)基重懸制成5 000個/mL的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板中。將細(xì)胞分為對照組和不同質(zhì)量濃度的PPP干預(yù)組，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，對照組加入完全培養(yǎng)基，PPP干預(yù)組加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的PPP藥液（PPP終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、150、200、250、300 μg/mL[12]）。每組設(shè)置6個復(fù)孔進(jìn)行重復(fù)試驗。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后，分別加入CCK-8檢測試液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度（OD），OD值越高，即表明細(xì)胞活性越高。計算PC3細(xì)胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（對照組平均OD值-PPP干預(yù)組平均OD值）/對照組平均OD值×100%，并據(jù)此計算PPP對PC3細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 PPP對PC3細(xì)胞周期的影響考察

采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，以完全培養(yǎng)基制成8 000個/mL的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中。將細(xì)胞分為對照組和PPP低、中、高質(zhì)量濃度組，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，對照組加入完全培養(yǎng)基，藥物組加入低、中、高質(zhì)量濃度的PPP藥液（質(zhì)量濃度參考“2.2”項下IC50值結(jié)果的0.5、1.0、2.0倍設(shè)置），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完畢后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2～3次，每次3 mL;以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，加入完全培養(yǎng)基3 mL，以1 000 r/min離心5 min;吸棄上清液，再用PBS 1 mL重懸細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min;吸棄上清，加入無水乙醇固定過夜;次日加入PI染料，在室溫下避光染色30 min，并于2 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期并計算各時相的細(xì)胞百分比。試驗重復(fù)3次。

2.4 PPP對PC3細(xì)胞凋亡的影響考察

采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，按“2.3”項下方法消化、接種、分組、給藥并培養(yǎng)48 h后再消化、離心。收集細(xì)胞，加入Binding Buffer 100 μL、Annexin V-FITC試劑5 μL和PI 試劑10 μL，混勻，在室溫下避光靜置15 min;再加入Binding Buffer 400 μL，用200目篩網(wǎng)濾過。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況并計算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率（%）=細(xì)胞凋亡數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。試驗重復(fù)3次。

2.5 PPP對PC3細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blotting法對凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白 LC3、Beclin-1、p62、Atg-12、Atg-16的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，按照“2.3”項下方法消化、接種、分組、給藥并培養(yǎng)48 h后再消化、離心。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液100 μL+苯甲基磺酰氟（PMSF）1 μL的混合液進(jìn)行裂解后，吹打細(xì)胞，在冰上放置2～3 h后，以12 000 r/min離心15 min。取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度后，煮沸蛋白使其變性。取變性后的蛋白適量，進(jìn)行SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)膜1.5 h，再封閉2 h，用TBST緩沖液洗滌之后分別加入Bax、Bcl-2、LC3、Beclin-1、p62、Atg12、Atg-16和GAPDH的一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;次日以TBST緩沖液洗滌后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），37 ℃下避光孵育2 h，然后加入ECL超靈敏發(fā)光液曝光。采用凝膠制備成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，以Image Lab 3.0軟件對目標(biāo)條帶進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參，按目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)水平。試驗重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PPP對PC3細(xì)胞增殖活性的影響

與對照組比較，隨著PPP質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸升高;當(dāng)以200 μg/mL及以上的PPP培養(yǎng)48 h時，細(xì)胞增殖抑制率不再明顯升高;當(dāng)以150～300 μg/mL的PPP分別培養(yǎng)24 h及以50～300 μg/mL的PPP分別培養(yǎng)48、72 h時，細(xì)胞增殖抑制率均顯著低于對照組（P<0.05或P<0.01），且PPP作用48、72 h時的細(xì)胞增殖抑制率較為接近。因此，后續(xù)試驗選擇48 h為培養(yǎng)時間。此外，根據(jù)SPSS 21.0軟件計算出PPP對PC3細(xì)胞的IC50值為110 μg/mL，并據(jù)此將后續(xù)試驗中PPP低、中、高質(zhì)量濃度分別設(shè)定為50、100、200 μg/mL（分別接近于0.5、1.0、2.0倍IC50）。PPP對PC3細(xì)胞的增殖抑制率見圖1。

3.2 PPP對PC3細(xì)胞周期分布的影響

與對照組比較，PPP低、中質(zhì)量濃度組G0/G1期細(xì)胞百分比均顯著降低，S期細(xì)胞百分比均顯著升高（P<0.01或P<0.05）;PPP高質(zhì)量濃度組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著升高（P<0.05）;PPP中、高質(zhì)量濃度組G2/M期細(xì)胞百分比均顯著降低（P<0.01）。PPP作用下PC3細(xì)胞周期的分布圖見圖2，不同時相細(xì)胞百分比見表1。

3.3 PPP對PC3細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，PPP低、中、高質(zhì)量濃度組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.01或P<0.05）。PPP作用下PC3細(xì)胞凋亡的散點圖見圖3，細(xì)胞凋亡率見表1。

3.4 PPP對PC3細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.4.1 凋亡相關(guān)蛋白 與對照組比較，PPP各質(zhì)量濃度組細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平均呈升高趨勢，其中PPP高質(zhì)量濃度組Bax蛋白表達(dá)水平較對照組顯著升高（P<0.05）;PPP各質(zhì)量濃度組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平均呈下降趨勢，其中PPP中、高質(zhì)量濃度組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均較對照組顯著降低（P<0.05）。PPP作用下PC3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖見圖4，蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表2。

3.4.2 自噬相關(guān)蛋白 與對照組比較，PPP各質(zhì)量濃度組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1、Atg12、Atg16蛋白表達(dá)水平總體呈升高趨勢，其中PPP高質(zhì)量濃度組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Atg12、Atg16蛋白表達(dá)水平以及PPP中、高質(zhì)量濃度組Beclin-1蛋白表達(dá)水平均較對照組顯著升高（P<0.05）;PPP各質(zhì)量濃度組細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)水平均較對照組顯著降低（P<0.05）。PPP作用下PC3細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖見圖5，蛋白表達(dá)水平見表3。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，PPP具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的作用[13]。細(xì)胞增殖抑制是藥物抑制作用的綜合性表現(xiàn)之一，其機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡、周期阻滯、壞死及衰老等原因有關(guān)。有研究表明，干預(yù)及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)而阻滯其生長是目前腫瘤治療的重要方法[14]。但目前并未見從分子機(jī)制方面報道PPP對人前列腺癌PC3細(xì)胞的促凋亡作用。因此，本研究采用CCK-8法檢測了不同質(zhì)量濃度PPP對PC3細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示PPP能抑制PC3細(xì)胞增殖;當(dāng)PPP質(zhì)量濃度為200～300 μg/mL、作用時間為48～72 h時，細(xì)胞增殖抑制率基本到達(dá)平臺期，且IC50為110 μg/mL，因此以50、100、200 μg/mL的PPP作用48 h進(jìn)行后續(xù)試驗。細(xì)胞凋亡和周期阻滯試驗的結(jié)果顯示，PPP能有效阻滯PC3細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，阻止細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)其凋亡。

現(xiàn)有研究表明，細(xì)胞凋亡與自噬活性的調(diào)控有關(guān)，自噬水平的下調(diào)可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長，通過藥物等干預(yù)方式上調(diào)自噬水平后，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-17]。在此基礎(chǔ)上，本研究將PPP作用于PC3細(xì)胞，并通過檢測細(xì)胞自噬水平來探索自噬活性對PPP誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡的影響，為闡明PPP抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制提供依據(jù)。Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要標(biāo)志性蛋白，其中促凋亡蛋白Bax接收到誘導(dǎo)凋亡信號后，能激活Caspase家族從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;而抗凋亡蛋白Bcl-2能影響線粒體膜的通透性，從而抑制Caspases的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，隨著PPP質(zhì)量濃度的升高，PC3細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平有不同程度的升高，Bcl-2的表達(dá)水平有不同程度的降低，表明PPP可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。

自噬本身作用機(jī)制及其在腫瘤中的作用非常復(fù)雜[18]，作為誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬的標(biāo)志性蛋白，LC3、Beclin-1是反映細(xì)胞自噬水平的重要標(biāo)志[19]。其中，LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，LC3-Ⅰ在磷脂酰乙醇胺的酯化作用下轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例的升高是自噬水平上升的標(biāo)志[20]。另一自噬標(biāo)志蛋白p62是細(xì)胞自噬的降解底物，當(dāng)自噬作用增強(qiáng)時，p62的降解增加，細(xì)胞中的p62蛋白表達(dá)水平隨之下降[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，自噬主要標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表達(dá)水平在PPP各質(zhì)量濃度組細(xì)胞中均有不同程度的升高，表明細(xì)胞自噬水平升高;p62表達(dá)水平則顯著降低，說明p62被降解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一結(jié)果與宋峰等[19]的研究一致。除此之外，自噬體的形成還有賴于自噬相關(guān)基因（ATG）相關(guān)蛋白的共價結(jié)合[21]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，自噬相關(guān)蛋白Atg12和Atg16表達(dá)水平明顯提高，說明在藥物干預(yù)過程中PC3細(xì)胞形成了自噬體[21]。這進(jìn)一步表明了PPP可能是通過誘導(dǎo)自噬進(jìn)而促進(jìn)凋亡這一機(jī)制而對PC3細(xì)胞增殖產(chǎn)生了抑制作用。

綜上所述，PPP能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。然而，PPP誘導(dǎo)自噬從而抑制腫瘤發(fā)展的相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚，還需進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2020-02-25 修回日期：2020-07-07）

（編輯：段思怡）