丹參多糖的含量測定、結(jié)構(gòu)表征及藥理活性研究進展

景永帥 馬云鳳 王非凡 張鈺煒 吳蘭芳 張丹參

摘 要 目的：為丹參多糖的進一步研究和開發(fā)提供參考。方法：以“丹參”“多糖”“含量測定”“結(jié)構(gòu)”“活性”“Salvia miltiorrhiza”“Polysaccharide”“Content determination”“Structure”“Activity”等為中英文關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、維普網(wǎng)、PubMed、ScienceDirect等數(shù)據(jù)庫中組合檢索1996年1月-2020年6月發(fā)表的相關(guān)文獻，對丹參多糖的含量測定、結(jié)構(gòu)表征和藥理活性進行歸納總結(jié)。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻889篇，其中有效文獻56篇。丹參多糖的提取方法包括水提醇沉法、熱水浸提法等，含量測定方法以苯酚-硫酸法為主，多由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖等組成，糖苷鍵連接方式以（1→6）-α-D-吡喃葡萄糖為主。丹參多糖具有保護心肌、保護肝臟、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性。目前，丹參多糖的含量測定、結(jié)構(gòu)表征與藥理活性研究已取得一定進展，但大多仍停留在實驗研究階段，尚需加強其工業(yè)化生產(chǎn)和相關(guān)制劑的研究。

關(guān)鍵詞 丹參多糖;含量測定;結(jié)構(gòu)表征;藥理活性

丹參為唇形科多年生草本植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，味苦、性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[1]，臨床常作為活血化瘀藥[2]。丹參是國家衛(wèi)健委公布的藥食同源藥材，主產(chǎn)于我國湖北、河南、山東、山西以及四川等地[3]。丹參的臨床應(yīng)用廣泛，用于冠心病、高血壓、慢性肝炎、腎病等癥的療效明顯。丹參多糖是丹參的主要有效成分之一[4-6]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及降血脂等多種生物活性[7]，被廣泛應(yīng)用于保健品和藥品中，具有較高的研究價值。丹參多糖作為天然的高分子化合物，其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)是影響多糖生物活性和作用機制的關(guān)鍵因素[6-9]，因此有必要對其含量測定、結(jié)構(gòu)表征及藥理活性研究進展進行匯總分析。為此，筆者以“丹參”“多糖”“含量測定”“結(jié)構(gòu)”“活性”“Salvia miltiorrhiza”“Polysaccharide”“Content determination”“Structure”“Activity”等為中英文關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、維普網(wǎng)、PubMed、ScienceDirect等數(shù)據(jù)庫中組合檢索1996年1月-2020年6月發(fā)表的相關(guān)文獻。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻889篇，其中有效文獻56篇?，F(xiàn)對丹參多糖的含量測定、結(jié)構(gòu)表征以及藥理活性的研究進展進行總結(jié)，以期為丹參多糖構(gòu)效關(guān)系的深入研究及丹參多糖類產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供參考。

1 丹參多糖的含量測定方法

目前，丹參多糖的提取方法包括水提醇沉法、熱水浸提法、超聲提取法等;含量測定方法主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法等，其中苯酚-硫酸法應(yīng)用較為廣泛[10]。包華音等[11]采用苯酚-硫酸法對9個不同產(chǎn)地丹參藥材中多糖的含量進行測定。結(jié)果顯示，陜西洛南產(chǎn)丹參中的多糖含量最高，為1.83 mg/g;山東臨朐產(chǎn)丹參中多糖含量最低，為1.22 mg/g。李炯等[12]采用水提醇沉法提取丹參藥材及其不同炮制品中的多糖。以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定其多糖含量。結(jié)果顯示，生丹參、酒丹參、醋丹參、米炒丹參和丹參炭中的多糖含量分別為3.08%、4.63%、4.25%、3.89%和1.41%。楊艷輝[13]以丹參的不同部位為原料，利用水提醇沉法提取多糖，采用苯酚-硫酸法測定其多糖含量，結(jié)果顯示，丹參根、莖、葉、花、種子的多糖含量比為24.88 ∶ 1.60 ∶ 1.52 ∶ 6.12 ∶ 1;其中，丹參根中多糖的含量最高，為70.84%。姜媛媛等[14]采用熱水浸提法從不同產(chǎn)地丹參根部中提取多糖，并用苯酚-硫酸法測定其多糖含量。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地丹參在結(jié)實期時多糖含量較低，分別為陜西丹參30.17%、江蘇丹參28.23%、北京丹參25.31%、湖北丹參22.11%、河南丹參17.53%;采收期時上述產(chǎn)地丹參的多糖含量則分別為66.53%、74.95%、77.95%、65.23%、52.00%。湯偉等[15]采用水提醇沉法提取丹參多糖，采用考馬斯亮藍(lán)法測得其蛋白質(zhì)的含量為8.96%。

2 丹參多糖的結(jié)構(gòu)表征

2.1 單糖組成

多糖結(jié)構(gòu)的研究分為初級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)[8]，隨著物理、化學(xué)及各種儀器分析技術(shù)的不斷進步，越來越多的技術(shù)手段被應(yīng)用到多糖的結(jié)構(gòu)分析中。其中，研究較多的是初級結(jié)構(gòu)，包括單糖組成、糖苷鍵連接方式、分子量的測定等[9]。

在進行丹參多糖單糖組成分析時，首先需將多糖進行酸水解，使糖苷鍵完全斷裂，之后再利用儀器分析技術(shù)進行測定，包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）等。Chen YA等[16]采用水提醇沉法提取丹參多糖，并采用GC法測得其單糖組成及其摩爾比為葡萄糖 ∶ 半乳糖 ∶ 阿拉伯糖 ∶ 鼠李糖 ∶ 半乳糖醛酸=3.26 ∶ 8.24 ∶ 4.79 ∶ 1 ∶ 6.52。Wang N等[17]采用水提醇沉法提取丹參得到粗多糖，又采用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100凝膠過濾柱分離純化得到多糖組分，經(jīng)過三氟乙酸水解、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化后，采用HPLC法測得該多糖的單糖組成及其摩爾比為葡萄糖 ∶ 阿拉伯糖 ∶ 木糖 ∶ 甘露糖 ∶ 半乳糖醛酸=1.42 ∶ 2.14 ∶ 1.16 ∶ 2.10 ∶ 1。汪紅等[18]采用HPCE法測得丹參粗多糖的單糖組成及其摩爾比為葡萄糖 ∶ 半乳糖 ∶ 阿拉伯糖 ∶ 鼠李糖 ∶ 木糖 ∶ 甘露糖 ∶ 核糖=12.7 ∶ 58.8 ∶ 15.3 ∶ 2.8 ∶ 1.0 ∶ 4.2 ∶ 8.5。Jiang YY等[19]采用超聲提取法提取丹參多糖，用DEAE-Sepharose CL-6B色譜柱純化，經(jīng)透析干燥后獲得多糖組分，通過GC-MS法分析得該多糖的單糖組成及其摩爾比為葡萄糖 ∶ 半乳糖 ∶ 阿拉伯糖 ∶ 木糖 ∶ 甘露糖 ∶ 核糖=1.45 ∶ 1.34 ∶ 1.57 ∶ 0.10 ∶ 1.95 ∶ 0.22。由此可知，丹參多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖以及半乳糖醛酸等組成，且不同提取、分離純化和分析方法所得的單糖組成及其摩爾比均有所差異。

2.2 糖苷鍵連接方式

測定糖苷鍵的連接方法可分為化學(xué)分析法和儀器分析法，化學(xué)分析法包括高碘酸氧化法[20]、Smith降解法[21]、甲基化法[22]等，目前應(yīng)用較多的是甲基化法。該方法首先將糖苷鏈甲基化，經(jīng)水解后采用GC-MS法進行測定。儀器分析法包括核磁共振法（NMR）、GC-MS法、紅外光譜法（IR）等。汪紅等[23]采用水提醇沉法提取丹參多糖，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱色譜分離、H2O2脫色、無水乙醇分步沉淀、透析、冷凍干燥后得到兩種多糖組分SMP 1和SMP 0.5，經(jīng)IR法測定上述兩種多糖均含吡喃型糖環(huán);13C-NMR法測定SMP 1主要以（1→6）-α-D-吡喃葡萄糖聚合而成，另有少量的（1→2）-α-D-吡喃葡萄糖聚合，SMP 0.5則由（1→6）-α-D-吡喃葡萄糖聚合而成。吳文林[24]采用IR法測得經(jīng)熱水浸提、超聲提取、堿提取和酶提取等4種不同方法提取的丹參多糖均為β-吡喃葡萄糖。Geng ZH等[25]對其提取的丹參多糖組分進行甲基化、水解、還原、乙?；?，采用GC-MS法測得其主鏈主要是由（1→3，6）-β-D-吡喃甘露糖基、（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖基、（1→3，6）-β-D-吡喃半乳糖基組成。

2.3 分子量

丹參多糖的分子量測定方法主要是凝膠滲透色譜法（GPC）。蔡亞平等[26]采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）分析了丹參多糖相對分子量的分布情況。結(jié)果顯示，丹參多糖的相對分子量分布明顯分為高相對分子量區(qū)和低相對分子量區(qū)兩部分，前者相對分子量分散性大，在104～106 Da之間;后者相對分子量分散性小，并顯示出單一相對分子量的特征，對應(yīng)的相對分子量為854 Da。吳從平[27]對2個丹參多糖樣品進行GPC檢測發(fā)現(xiàn)，以保留時間為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖相對分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而求得2個樣品的相對分子量分別約為1.389×106、4.028×105 Da。Jiang YY等[28]對丹參進行提取、分離純化得到多糖組分，采用GPC法測定其分子量，發(fā)現(xiàn)僅檢測到洗脫峰，表明該多糖組分是均一多糖，采用校準(zhǔn)曲線法算得其平均分子量約為5.27×105 Da。

2.4 理化性質(zhì)

多糖理化性質(zhì)的測定包括形態(tài)特征、比旋光度、黏度、溶解度、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量等的測定。Jiang YY等[28]測定了丹參藥渣多糖SMWP-1在不同溶劑中的溶解度，并借助圓盤旋光儀測定其比旋光度，使用烏氏毛細(xì)管黏度計在37 ℃下測量SMWP-1的黏度，采用硫酸-咔唑法測定其糖醛酸含量，采用Bradford法測定其蛋白質(zhì)含量。結(jié)果顯示，SMWP-1可溶于水和二甲基亞砜，但不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，比旋光度[α]20 D為+47.4°，黏度為34.74 cm3/g，糖醛酸含量為0.13%，蛋白質(zhì)含量為0.53%。姜媛媛[29]采用烏貝路德黏度計測定經(jīng)4種不同方法提取的丹參多糖的黏度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參多糖的黏度隨多糖溶液濃度的增加而增大，隨溫度的升高而急劇降低，4種方法提取的丹參多糖的特性黏度由大到小依次為堿提取法、酶提取法、超聲波提取法、熱水浸提法，對應(yīng)的特性黏度值分別為43.06、41.78、39.85、34.74 cm3/g。鞏健[30]采用復(fù)合酶法提取白花丹參多糖，并對其理化性質(zhì)進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白花丹參多糖易溶于水，難溶于乙醚、丙酮等有機溶劑;用pH計測定樣品溶液的pH值為6.03，表明其為酸性多糖;碘-碘化鉀試劑反應(yīng)為陰性，表示樣品溶液中無淀粉存在;采用自動旋光儀測得該多糖在波長589 nm處的旋光度值為-0.101，比旋光度為-50.5，提示白花丹參多糖為左旋型;旋轉(zhuǎn)流變儀測定結(jié)果表明，樣品多糖溶液的黏度隨溫度的升高和剪切速度的增大而下降，表現(xiàn)為剪切稀化，表明白花丹參多糖水溶液為假塑性流體。Wu WL等[31]將經(jīng)超聲提取法、堿提法、酶解法和熱水浸提法等4種不同提取方法所得的丹參多糖干燥后，用掃描電鏡觀察丹參多糖表面的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)熱水浸提法提取的多糖表面平整無折痕，晶體間較為緊實;超聲提取法提取的多糖表面凹凸不平，有不規(guī)則褶皺，晶體間有很大的空洞;堿提法提取的多糖呈海綿狀，整體結(jié)構(gòu)極為松散，間隙很大;酶解法提取的多糖表面十分光滑，并具有直徑為2～5 μm的明顯孔洞。

3 丹參多糖的藥理活性

3.1 保護心肌作用

周鳳華等[32]用丹參多糖預(yù)先處理乳鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)丹參多糖能有效改善H2O2導(dǎo)致的乳鼠心肌細(xì)胞損傷，并推測丹參多糖保護心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用與促增殖蛋白表達(dá)有關(guān)，其可能通過上調(diào)該蛋白在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來減少H2O2所致的細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護心肌細(xì)胞的作用。Geng ZH等[33]研究了丹參多糖對異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的大鼠心肌梗死（MI）的心臟保護作用。結(jié)果表明，長期口服丹參多糖可增強機體內(nèi)源性抗氧化和降血脂活性，為ISO致大鼠心臟損害提供重要保護。Song MB等[34]研究了丹參多糖對大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）損傷的保護作用。結(jié)果顯示，丹參多糖可顯著縮小I/R模型大鼠的心肌梗死面積，逆轉(zhuǎn)其血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶和心肌細(xì)胞丙二醛（MDA）含量的升高以及心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的降低;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）分析結(jié)果表明，丹參多糖可改善大鼠氧化應(yīng)激并抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到保護心肌的目的。張建成等[35]用丹參多糖對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型大鼠進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)丹參多糖可減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和促凋亡蛋白的表達(dá)，提高心肌細(xì)胞活力;同時，采用自噬抑制劑或激活劑聯(lián)合丹參多糖對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型大鼠進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)丹參多糖可通過促進自噬作用而抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用。由此可見，丹參多糖具有保護心肌的作用，其作用機制可能與改善心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡和促進自噬等有關(guān)。

3.6 其他作用

丹參多糖除具有保護心肌、保護肝臟、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等活性外，還具有改善腎病變[7]、保護神經(jīng)[52]、抗炎[53]、降血壓[54]、抗疲勞[26]、降血脂[33]等作用。Zhang W等[55]從丹參中分離出生物活性多糖SMPW1，并研究了其對過氧化氫叔丁基（t-BHP）誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型大鼠的保護作用。結(jié)果顯示，SMPW1可顯著提高該模型大鼠的CAT、SOD和GSH-Px含量并降低血清和肝臟勻漿中MDA含量;此外，SMPW1還可減輕t-BHP誘導(dǎo)的胰島素抵抗以及肝臟、胰腺損傷，并可改善大鼠胰島素敏感性指數(shù)，表明SMPW1可以抑制胰島素抵抗模型大鼠2型糖尿病的發(fā)展，同時還可通過減少氧化應(yīng)激來改善大鼠的胰島素抵抗。Shen T等[56]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍公豬精液過程中，丹參多糖可以保護公豬精子免受過氧化損傷，并增強精子活力，提高受孕率，推測其有望應(yīng)用于人類或瀕危野生動物的精子保存中。

4 結(jié)論與展望

大量的藥理研究表明，丹參多糖有較高的藥用價值，在保護心肌、保護肝臟以及調(diào)節(jié)免疫等方面均具有較好的活性。目前，丹參多糖的含量測定、結(jié)構(gòu)表征與藥理活性研究已取得一定進展，但大多仍停留在實驗研究階段，尚需加強其工業(yè)化生產(chǎn)和相關(guān)制劑的研究。如丹參多糖的提取純化手段仍不成熟，其質(zhì)量控制指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)尚不完善，高級結(jié)構(gòu)研究較少，具體藥理作用機制、構(gòu)效關(guān)系以及丹參資源道地性與丹參多糖活性間的相關(guān)性等仍需更加科學(xué)深入的研究，以便更好地開發(fā)和利用丹參多糖。

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（收稿日期：2020-03-18 修回日期：2020-07-15）

（編輯：孫 冰）