自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)病機(jī)制及與血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究

劉長召，王 玲，盧新林，陳文江

高血壓是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，50%～60%的腦卒中和40%～50%的心肌梗死都與高血壓有關(guān)，高血壓患病率呈明顯上升趨勢，目前，我國15歲以上人口的高血壓患病率達(dá)24%，估算有2.66億高血壓病人。而值得重視的是，隨著人口老齡化的加速，我國老年高血壓的患病率已經(jīng)大幅增加，在60～69歲人群中，高血壓患病率超過40%，而且隨著年齡增加患病率逐漸上升，在75歲以上人群中患病率已經(jīng)超過60%[1-2]。由于老年人的絕對人數(shù)和占人口的構(gòu)成比不斷增長，影響老年人健康長壽和生命質(zhì)量的主要疾病中，高血壓是一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。高血壓病人往往具有病程長、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，而且隨著病程發(fā)展，會(huì)出現(xiàn)心、腦、腎等靶器官損害，其中，以心臟損害最為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為左心室心肌肥厚、室間隔肥大、心臟纖維化、心室重構(gòu)、心室舒張功能障礙及明顯的氧化應(yīng)激損傷等，晚期往往導(dǎo)致心力衰竭[3-5]。

隨著高血壓的發(fā)展，靶器官心臟損害越來越明顯，其發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，目前多認(rèn)為是多種因素共同導(dǎo)致。其中，心臟的纖維化在靶器官損害中扮演著重要角色，而心臟的纖維化主要認(rèn)為與多種纖維化因子的紊亂有關(guān)，且心臟纖維化與纖維化因子互為因果，互相影響[6-8]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)為心臟較為重要的纖維化因子，現(xiàn)被證實(shí)參與心肌梗死后心臟的纖維化過程[9-11]。本研究擬采用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)模型，研究高血壓靶器官心臟的損害機(jī)制，以期為高血壓治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究方向。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與標(biāo)本采集 20只雄性SHR(6月齡)，分為兩組：SHR模型組及給予氨氯地平(購于上海通用藥業(yè)公司)10 mg/(kg·d)喂養(yǎng)的模型對照組(氨氯地平模對照組)，每組10只；另取10只Wistar-Kyoto rats(WKY)作為WKY正常對照組，皆由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將3組大鼠喂養(yǎng)12周，SHR模型組與WKY正常對照組大鼠給予正常標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，而氨氯地平模型對照組SHR則在標(biāo)準(zhǔn)飼料中混入氨氯地平進(jìn)行喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)周期為12周，每周測1次大鼠血壓(用鼠尾靜脈血壓儀進(jìn)行測量)和體重。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，先采集各組大鼠右心室血液2 mL，然后獲取大鼠心臟組織。

1.2 試劑與儀器 VEGF和FGF ELISA試劑盒由深圳柏萬森生物有限公司提供，核酸蛋白測量儀(Biophotometer，Eppendorf公司)，PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf公司，德國)，LightCycler480II全自動(dòng)熒光定量PCR儀(羅氏，瑞士)，全自動(dòng)酶標(biāo)議(BIO-RAD，美國)，穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(BIO-RAD，美國)，垂直電泳槽(BIO-RAD，美國)，電轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司 )，TRIZOL試劑(Invitrogen，美國)，PCR引物(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成)，VEGF和FGF抗體(武漢博士德生物試劑公司)，Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，PMSF(碧云天生物技術(shù)研究所)，增強(qiáng)型BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 ELISA檢測血漿VEGF和FGF 將所獲取的各組大鼠全血進(jìn)行離心(3 000 r/min，24 ℃，10 min)分離血漿，取各組大鼠血漿，按照ELISA試劑盒說明書對血漿VEGF和FGF進(jìn)行檢測，觀察其變化情況。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 qRT-PCR提取大鼠心臟組織RNA 首先應(yīng)用TRIZOL按照說明書提取所獲取各組大鼠心臟組織的RNA，最后所得RNA吸光度值A(chǔ)260/A280在1.7～2.1為合格。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將所提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后將逆轉(zhuǎn)錄所獲取的cDNA模板按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量，其中，預(yù)變性30 s，95 ℃；擴(kuò)增、延伸15 s，95 ℃；退火30 s，60 ℃，共40個(gè)循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參。VEGF引物：上游TCCAATTGAGACCCTGGTGGA，下游AAGGCTCACAGTGAACGCTCC；FGF引物：上游AACACTTACCGGTCACGGAA，下游CAGGGTGGCTAGGCTACTACT；β-actin引物，上游GCAGGAGTACGATGAGTCCG，下游ACGCAGCTCAGTAACAGTCC。本研究采用2-ΔCt相對定量方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因)-Ct(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標(biāo)基因)-Ct(對照組內(nèi)參)。

1.5 用Western Blot檢測大鼠心臟組織VEGF和FGF蛋白表達(dá) 將所獲取的各組大鼠心臟組織左心室進(jìn)行分離，提取蛋白質(zhì)，采用BCA法測量蛋白濃度，繼而進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、VEGF和FGF一抗孵育、二抗孵育、雜交、顯影、曝光。VEGF稀釋比例1∶1 000，F(xiàn)GF稀釋比例1∶1 000，內(nèi)參選用β-actin(稀釋比例1∶1 000)。結(jié)果分析用Image J圖像分析軟件計(jì)算條帶灰度值，最后結(jié)果為目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血壓情況 3組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間生長良好，SHR模型組死亡1只，另外兩組未見死亡。 SHR在進(jìn)行氨氯地平喂養(yǎng)后，血壓可以明顯下降，與SHR模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在12周時(shí)與WKY正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明氨氯地平可有效降低SHR血壓。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間收縮壓情況比較(±s) 單位：mmHg

2.2 各組大鼠血漿VEGF和FGF表達(dá)情況 3組大鼠血漿ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR模型組血漿VEGF和FGF的表達(dá)較WKY正常對照組和氨氯地平模型對照組升高(P<0.05)，氨氯地平模型對照組血漿VEGF和FGF的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，然而仍然高于WKY正常對照組(P<0.05)。詳見表2。說明VEGF和FGF與SHR高血壓的發(fā)生有關(guān)。

表2 各組大鼠血漿VEGF和FGF的ELISA檢測情況比較(±s) 單位：ng/L

2.3 各組大鼠心臟組織VEGF和FGF mRNA表達(dá)情況 提取3組大鼠心臟組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn)SHR模型組心臟組織VEGF和FGFmRNA表達(dá)較氨氯地平模型對照組與WKY正常對照組明顯增加(P<0.05)，而氨氯地平模型對照組則與WKY正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。說明VEGF和FGF在SHR大鼠的心臟靶器官損害中起著重要作用，且隨著藥物的應(yīng)用，高血壓進(jìn)程不再惡化，基因的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與SHR模型組比較，＊P<0.05。

2.4 各組大鼠心臟組織VEGF和FGF 蛋白表達(dá)情況 SHR模型組VEGF和FGF蛋白表達(dá)較氨氯地平模型對照組與WKY正常對照組的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而氨氯地平模型對照組則與WKY正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2、圖3。說明SHR高血壓的發(fā)生發(fā)展可能與VEGF和FGF有關(guān)。

圖2 各組大鼠心臟組織VEGF和FGF蛋白表達(dá)情況(電泳圖)(A為 WKY正常對照組；B為 SHR模型組；C為氨氯地平模型對照組)

與SHR模型組比較，＊P<0.05。

3 討 論

目前我國老年高血壓病人已達(dá)8 346萬人，而且老年高血壓患病人數(shù)呈持續(xù)增加趨勢，隨著年齡增加患病率逐漸上升，75歲以上人群患病率已經(jīng)超過60%；老年高血壓發(fā)病率在男女性別間不同，60歲以上男性發(fā)病率為41.6%，而女性為38.4%。由于老年人的絕對人數(shù)和占人口的構(gòu)成比在不斷增長，高血壓已經(jīng)嚴(yán)重影響老年人的健康和生命質(zhì)量，成為嚴(yán)重危害健康的心血管疾病[12-13]。高血壓發(fā)病機(jī)制目前主要認(rèn)為與遺傳因素(主要有單基因遺傳模式和多基因遺傳模式，其中多基因遺傳模式是主要的一種，而單基因遺傳模式只存在于少數(shù)高血壓病人中)、大動(dòng)脈彈性減退(動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化和纖維性硬化)、周圍血管阻力升高、腎臟排鈉能力下降、交感神經(jīng)系統(tǒng)α受體功能亢進(jìn)、血小板功能減退、壓力感受器功能下降等機(jī)制有關(guān)[3，14]。高血壓對人體的損傷主要通過靶器官心、腦、腎、眼底等來實(shí)現(xiàn)，尤其對心臟的損害較為常見，往往導(dǎo)致心室肥厚、心肌纖維化等，而目前研究表明高血壓病理生理過程與VEGF、FGF等因子密切相關(guān)。

VEGF也稱血管通透因子(vascular permeability factor，VPF) 或者促血管因子(vasculotropin，VAS)，其作用是能夠特異性地直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙，甚至改變其基因表達(dá)，是促進(jìn)血管生成的重要因子[9，15-18]。有研究證實(shí)原發(fā)性高血壓病人的血漿VEGF水平正較常人明顯升高[8，19]；另有研究證實(shí)VEGF隨著原發(fā)性高血壓的發(fā)展而在心肌細(xì)胞中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)[20-21]。FGF是一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的多肽家族，在體內(nèi)的許多組織和器官內(nèi)均有分布，其作用主要是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的游走和平滑肌細(xì)胞的增殖，但是不能使平滑肌細(xì)胞游走；同時(shí)能夠促進(jìn)新血管形成，修復(fù)損害的內(nèi)皮細(xì)胞[7，10，14]。有研究證實(shí)FGF與高血壓的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，并導(dǎo)致心室肥厚[2，11，18]。

本研究通過SHR動(dòng)物模型，以WKY作為對照，并采用氨氯地平進(jìn)行治療，研究高血壓靶器官心臟的損害機(jī)制，通過對VEGF和FGF在3組大鼠血漿水平和心臟組織基因和蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn)，SHR中VEGF和FGF無論在血漿蛋白還基因和組織蛋白水平較氨氯地平模型對照組與WKY正常對照組的表達(dá)明顯增加，而氨氯地平模型對照組則與WKY正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明VEGF和FGF參與了SHR靶器官心臟損害，可能在高血壓的發(fā)展中起著重要作用。

本研究通過SHR模型探討VEGF和FGF對高血壓發(fā)病機(jī)制的影響，在動(dòng)物模型和分子生物學(xué)層面進(jìn)行探討，結(jié)果表明VEGF和FGF在SHR表達(dá)明顯升高，經(jīng)過氨氯地平處理后會(huì)相應(yīng)下降，說明VEGF和FGF與高血壓發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，可為高血壓的靶向及基因治療等提供新思路和新方法。由于本研究是動(dòng)物模型研究，有可能導(dǎo)致結(jié)果與臨床有差異，且本研究只是一個(gè)初步研究，對于VEGF和FGF的具體機(jī)制未進(jìn)行信號通路阻斷及上下游基因探討，有待繼續(xù)深入研究以探明VEGF和FGF在高血壓中的確切作用機(jī)制。