近紅外光譜法快速測(cè)定化橘紅中柚皮苷的含量

梁 穎 ， 高鴻彬 ， 李曉丹 ， 楊松林 ， 馬 麗 ， 劉 浩 *

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，廣東 廣州 510520；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；3.廣州安諾科技股份有限公司，廣東 廣州 510863）

2016年5 月，化橘紅入選廣東嶺南中藥材第一批立法保護(hù)品種，是產(chǎn)于廣東化州的珍稀名貴特產(chǎn)，為“中國(guó)四大南藥”和“十大廣藥”之一?；偌t為蕓香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，臨床多用于治療咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等癥[1-6]。在化州種植的橘紅稱為化橘紅，為道地藥材，比產(chǎn)于異地的同種藥材的質(zhì)量更好。正宗的化橘紅制作工藝復(fù)雜、成本高，其銷售價(jià)格較為昂貴。不少商家為牟取暴利而出售假冒偽劣化橘紅產(chǎn)品，因此導(dǎo)致化橘紅的假貨和偽品成堆出現(xiàn)。而且其外形氣味一般與真貨及其相似，以至于普通消費(fèi)者難以辨別化橘紅的真假。

化橘紅主要有效成分是黃酮類化合物，其中最主要是柚皮苷和野漆樹(shù)苷，二者含量之和占化橘紅黃酮類物質(zhì)總量的84%以上。其中《中國(guó)藥典》2015年版中的關(guān)鍵指標(biāo)為柚皮苷含量，許多文獻(xiàn)研究也已經(jīng)證明柚皮苷是化橘紅的主要有效成分之一[7-9]?；偌t在《中國(guó)藥典》2015年版中要求柚皮苷含量不低于3.5%[7]，而《中國(guó)藥典》2005年版僅要求柚皮苷含量不低于1.5%，兩者相比足足提高了2倍多。

有關(guān)化橘紅含量測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道，化橘紅中柚皮苷的含量測(cè)定方法一般用紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Vis）、高效液相色譜法（HPLC）等[9-14]。而傳統(tǒng)的檢測(cè)化橘紅中柚皮苷含量的方法雖然檢測(cè)精度高，但是操作過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、耗用大量試劑，并且還會(huì)對(duì)化橘紅的樣本造成一定的破壞性傷害，無(wú)法實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)成本低廉的快速無(wú)損檢測(cè)。因此建立快速測(cè)定柚皮苷的含量方法，是非常有必要的。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)，本文采用近紅外光譜法進(jìn)行了系統(tǒng)的化橘紅快速鑒別和含量測(cè)定研究。近紅外光譜法具有信息量大、便捷、快速、無(wú)損等特點(diǎn)，可作為藥品、食品等的快速檢測(cè)手段，可以實(shí)現(xiàn)樣品的快速鑒別和化學(xué)成分的快速測(cè)定[15-21]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

化橘紅藥材，購(gòu)自多家醫(yī)院藥房和零售藥店，產(chǎn)地來(lái)自于廣東化州、廣西等化橘紅主要產(chǎn)區(qū)，44個(gè)批次的樣品；柚皮苷對(duì)照品（純度：98%），購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司；甲醇（色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司）；乙酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；石油醚（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；水為純凈水（怡寶牌）。

1.2 儀器設(shè)備

SupNIR-2700近紅外光譜分析儀（聚光科技(杭州）股份有限公司），Agilent-1260型高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機(jī)、DAD 檢測(cè)器等）（Agilent公司），C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）（Agilent公司），CJ-100S超聲清洗儀器（深圳市超潔科技實(shí)業(yè)公司），二兩裝高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司），BAS224S電子天平（德國(guó)Sartorius公司），三號(hào)篩網(wǎng)（50目）（上虞市道墟五四儀器紗篩廠），微孔濾膜（規(guī)格為0.22 μm）（津騰牌）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 采集近紅外光譜數(shù)據(jù)

將化橘紅樣品干燥，粉碎過(guò)三號(hào)篩網(wǎng)（50目），密封，干燥保存，即得化橘紅樣品粉末。各稱取44份化橘紅樣品粉末3 g，裝入石英瓶，壓實(shí)，進(jìn)行測(cè)定。近紅外光譜儀參數(shù)設(shè)置為：光譜采集范圍為2 500～1 000 nm；分辨率為1 nm；掃描次數(shù)為64次；測(cè)樣方法為積分球漫反射，用于建立模型。44個(gè)化橘紅樣品的近紅外光譜疊加圖如圖1所示，每條譜線由1557個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)構(gòu)成。

圖1 近紅外光譜疊加圖

1.3.2 化橘紅中柚皮苷的含量測(cè)定

1.3.2.1化橘紅中柚皮苷的提取

各取化橘紅樣品44批，置于玻璃干燥器中干燥過(guò)夜，取出，粉碎過(guò)50目篩，精密稱定1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL石油醚，超聲處理30 min，取出放冷后，過(guò)濾，棄去濾液，將濾紙剪碎塞回錐形瓶中，放置通風(fēng)櫥等石油醚揮干。準(zhǔn)確加入50 mL甲醇至錐形瓶中，精密稱定，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm濾膜，即得。

1.3.2.2供試品溶液的制備

準(zhǔn)確量取上述“1.3.2.1”提取溶液4.0 mL至干凈干燥的10 mL量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.2.3對(duì)照品溶液的制備精密稱取柚皮苷對(duì)照品0.031 45 g，置10 mL具塞量瓶中，加甲醇溶解，定容，于冰箱2～8℃保存。同時(shí)配制甲醇-水（1∶1）用以稀釋對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2.4色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（150 mm×4.6mm，4 μm）；流動(dòng)相：0.5%乙酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，30% B；5～28 min，35% B；28～40 min，95% B）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量20 μL。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到對(duì)照品和樣品色譜圖，如圖2a、2b所示。

圖2 對(duì)照品（a）和樣品（b柚皮苷）HPLC圖

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品含量測(cè)定

按“1.3.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定44批化橘紅中柚皮苷的含量，含量測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 化橘紅中柚皮苷的含量

（續(xù)表1）

從表1可以看出，不同批次的化橘紅樣品中柚皮苷的含量差異非常大，最高為9號(hào)樣品，含量為25.89%，最低為33號(hào)樣品，含量為1.55%，盡管在售賣的時(shí)候都標(biāo)以化橘紅，實(shí)際上質(zhì)量差異非常大，部分是以一般橘紅冒充化橘紅的，達(dá)不到應(yīng)有的治療效果。在44批樣本中，21、32、33的柚皮苷含量未達(dá)到中國(guó)藥典的規(guī)定（3.5%），大多數(shù)樣本是符合藥典質(zhì)量要求的，事實(shí)上，在符合藥典的產(chǎn)品中，柚皮苷的含量差異也是比較大的，其中價(jià)格比較高的乳果含量最高。

對(duì)于一般人員來(lái)說(shuō)，判斷不同化橘紅的質(zhì)量是比較困難的，而高效液相色譜等含量測(cè)定方法專業(yè)性強(qiáng)、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，也給化橘紅的質(zhì)量判斷帶來(lái)了障礙。

2.2 模型的建立與驗(yàn)證

2.2.1 化橘紅中柚皮苷定量分析模型的建立方法

采用偏最小二乘法（PLS）建立校正化橘紅中柚皮苷含量的模型。近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理的方法有：一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、矢量歸一化、最小-最大歸一化、多元散射校正等。在每個(gè)化橘紅中柚皮苷含量指標(biāo)模型的建立中，光譜預(yù)處理方法的選擇原則一般是使得偏最小二乘法能夠在光譜數(shù)據(jù)和柚皮苷含量指標(biāo)數(shù)據(jù)間建立最佳的相關(guān)關(guān)系。分析模型檢驗(yàn)方法采用交叉留一驗(yàn)證來(lái)建立。以上計(jì)算使用 BRUKER公司OPUS 7.8執(zhí)行。

2.2.2 主因子數(shù)的選擇

主因子數(shù)的選擇影響建模結(jié)果的好壞。本研究中，柚皮苷主因子數(shù)的篩選和校正均方差之間的關(guān)系圖如圖3所示，柚皮苷以主因子數(shù) 8建模，RMSECV值最小。

圖3 主因子數(shù)對(duì)甘草酸定量分析模型校正均方差的影響

2.2.3 不同預(yù)處理方法優(yōu)化的校正模型選擇結(jié)果

建立化橘紅中柚皮苷模型后，采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)有建模集和驗(yàn)證集變量間的線性關(guān)系（R）、建模集交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）。對(duì)于同一化橘紅樣品集所構(gòu)建的近紅外定量分析校正模型，相關(guān)系數(shù)R2越接近1、均方差 RMSECV越小，表示模型擬合能力越佳，所建柚皮苷的模型適用性越強(qiáng)、回歸（預(yù)測(cè)）結(jié)果越好[20]。經(jīng)過(guò)篩選不同預(yù)處理方法優(yōu)化的校正模型比較結(jié)果，最終確定一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正為光譜預(yù)處理方法，檢驗(yàn)方法采用交叉驗(yàn)證以2 350～2 199 nm、1 750～1 600 nm和1 301～1 150 nm的波長(zhǎng)作為最佳范圍，如表2所示。

表2 不同預(yù)處理方法對(duì)模型的影響

表3 不同波長(zhǎng)范圍對(duì)模型的影響

從表2和3可以看出不同預(yù)處理方法或者不同波長(zhǎng)范圍對(duì)模型的影響是不同的。其中一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法得到了最優(yōu)的結(jié)果，一階導(dǎo)數(shù)可以消除樣本各成分之間光譜之間的相互干擾導(dǎo)致的光譜重疊，提高分辨率，多元散射校正主要用來(lái)消除樣本顆粒分布的不均勻，以及顆粒大小差異而導(dǎo)致的光散射影響，說(shuō)明化橘紅在粉碎時(shí)不同的顆粒大小對(duì)結(jié)果影響較大。

2.2.4 化橘紅中柚皮苷定量分析模型的建立

以44批化橘紅樣品中35份組成模型的校正集，8份作為驗(yàn)證集，用一階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化作為近紅外光譜預(yù)處理方法，以2 350～2 199 nm、1 750～1 600 nm和1 301～1 150 nm的波長(zhǎng)為最佳波段范圍，平滑點(diǎn)數(shù)為17，柚皮苷校正模型的交叉檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)R2＝0.978，校正均方差 RMSECV＝0.997，各項(xiàng)參數(shù)的評(píng)價(jià)良好。近紅外光譜預(yù)測(cè)值與真值的相關(guān)圖如圖4所示。

圖4 化橘紅NIR預(yù)測(cè)值與真值的相關(guān)性

3 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定含量結(jié)合近紅外光譜檢測(cè)技術(shù)，利用偏最小二乘回歸分析結(jié)合交叉驗(yàn)證法，建立快速測(cè)定化橘紅中柚皮苷含量的模型。建立的校正模型的相關(guān)系數(shù)和內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差分別為：R2＝0.978，RMSECV＝0.997，表明預(yù)測(cè)結(jié)果良好。該法的建立證明了近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于化橘紅藥材中柚皮苷含量測(cè)定的可行性。

本實(shí)驗(yàn)是定量分析模型，其準(zhǔn)確性是在大量具有代表性樣品的精準(zhǔn)測(cè)定及模型后期持續(xù)不斷的完善之上而建立的。在建立檢測(cè)化橘紅柚皮苷含量的過(guò)程中，樣品代表性越強(qiáng)，模型的實(shí)用性就越強(qiáng)，但是這需花費(fèi)大量的時(shí)間和精力。從檢測(cè)化橘紅中柚皮苷含量的建立模型過(guò)程來(lái)看建立的過(guò)程是非常關(guān)鍵的，它將會(huì)直接影響近紅外光譜分析柚皮苷含量的工作效率和質(zhì)量。只有選擇合適的預(yù)處理方法和合適的波長(zhǎng)范圍來(lái)減少光譜的干擾信息，才能獲得較理想的結(jié)果。柚皮苷的近紅外模型建成后，只需掃描獲得化橘紅樣品的近紅外光譜圖，根據(jù)模型即可直接預(yù)測(cè)出化橘紅中柚皮苷的含量，可以使繁瑣的常規(guī)分析方法變得簡(jiǎn)便易行且快速無(wú)損。本文所建立的模型對(duì)于測(cè)定化橘紅中柚皮苷是非常有效的，值得借鑒和推廣使用。