檢測活性硫物種小分子熒光探針的研究進(jìn)展

劉喜靈， 張淑平*

（上海理工大學(xué) 理學(xué)院，上海 200093）

活性硫物種（RSSs）是一類具有氧化還原活性的含硫小分子，在維持生物體的穩(wěn)態(tài)過程中起重要作用。生物體內(nèi)活性硫的生成與清除處于平衡狀態(tài)，從而保障生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。當(dāng)這一平衡被打破，導(dǎo)致活性硫物種濃度超過生理限度時(shí)就會(huì)損傷體內(nèi)的物質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)一系列疾病，如癌癥、神經(jīng)衰退性疾病、心血管疾病、糖尿病等[1]。由于其難以捉摸的性質(zhì)和多種形式，了解其如何影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)及其作用分子機(jī)制對疾病藥物的研究起關(guān)鍵作用。鑒于活性硫物種的高度重要性，迫切需要用于監(jiān)測其在體內(nèi)的濃度和分布的有效工具。

熒光成像作為一種有效的研究方法已廣泛用于生物學(xué)研究中。由于具有高選擇性、快速響應(yīng)、低毒性和高的時(shí)空分辨率等特點(diǎn)，而被廣泛設(shè)計(jì)成包括各活性硫物種在內(nèi)的各種底物的熒光探針。因此，開發(fā)性能良好的熒光探針成為了研究的關(guān)鍵。

本綜述總結(jié)了近兩年內(nèi)檢測生物硫醇、H2S以及SO2衍生物的熒光探針，強(qiáng)調(diào)了探針在設(shè)計(jì)、傳感機(jī)制、傳感性能和生物應(yīng)用方面的基本特征，為新型活性硫熒光探針的設(shè)計(jì)提供了指導(dǎo)方法。

1 同時(shí)區(qū)分生物硫醇熒光探針的研究進(jìn)展

谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）等生物硫醇在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、充當(dāng)抗氧化劑和自由基清除劑方面起著重要作用[2]。例如，GSH可以充當(dāng)ONOO-清除劑。GSH含量升高可以保護(hù)氧化應(yīng)激的細(xì)胞，細(xì)胞對ONOO-的敏感性在很大程度上取決于存在的細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度[3]。Cys參與蛋白質(zhì)合成、生物氧化還原穩(wěn)態(tài)和排毒等多個(gè)生物學(xué)過程[4]，與心血管疾病、發(fā)育遲緩和肝損傷相關(guān)。而Hcy可以激活各種信號途徑來誘導(dǎo)內(nèi)在的促凋亡機(jī)制，這種機(jī)制通常與心血管疾病有關(guān)[5]。為了了解各自的作用機(jī)理，區(qū)分三種硫醇具有重要的生物學(xué)意義。

生物硫醇類探針，一般通過不同的熒光信號來區(qū)分 Cys/Hcy/GSH，其檢測機(jī)制大多基于硫醇的巰基與氨基和多反應(yīng)位點(diǎn)探針發(fā)生不同的化學(xué)反應(yīng)生成不同熒光性質(zhì)的產(chǎn)物來區(qū)分的。2018年，Huang Jing等[6]開發(fā)出一種以磺?；讲⒍蜃鳛樽R別點(diǎn)，設(shè)計(jì)了新型熒光探針1，用于區(qū)分Hcy和GSH。探針1容易合成且收率高，同時(shí)對Hcy和GSH的檢測具有很高的選擇性。探針1還顯示出與Hcy的比例熒光響應(yīng)，該探針已成功用于監(jiān)測活細(xì)胞中的Hcy和GSH。圖1是區(qū)分生物硫醇的探針1-3和機(jī)理圖。

同年，Yin的小組報(bào)告了一個(gè)具有四個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的多通道熒光探針2[7]。在Cys存在下，457 nm處的熒光發(fā)射增強(qiáng)了108倍。而在Hcy的作用下559 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的發(fā)射峰，GSH在529 nm處誘導(dǎo)了熒光增強(qiáng)。最近，此研究小組通過引入氨基供體部分和 2-氰基丙烯酸乙酯基團(tuán)設(shè)計(jì)了探針 3[8]，從而提高了探針的量子產(chǎn)率及其在水中的溶解度。重要的是，探針3已成功應(yīng)用于活細(xì)胞中具有三個(gè)通道的內(nèi)源性生物硫醇成像。

圖1 區(qū)分生物硫醇的探針和機(jī)理圖

2 H2S 熒光探針的研究進(jìn)展

H2S是一種內(nèi)源性氣態(tài)遞質(zhì)，可調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，包括神經(jīng)傳遞、血管舒張、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、氧化應(yīng)激和胰島素信號傳導(dǎo)抑制等[9]。H2S的生物學(xué)重要性促進(jìn)科研工作者開發(fā)出相應(yīng)的熒光探針。

2.1 疊氮基還原機(jī)理

許多研究表明，疊氮基是一種H2S的出色識別受體，它易于引入并且對H2S具有高度特異性。疊氮基是一種熒光猝滅取代基團(tuán)，H2S可以將疊氮化物還原為氨基，來實(shí)現(xiàn)熒光的開啟?；诖藱C(jī)理，2019年，F(xiàn)ang課題[10]基于羅丹明的共軛體系構(gòu)建了一種檢測H2S的新型可捕獲紅色熒光的探針4。與H2S作用后，630 nm處的熒光大大增強(qiáng)。探針4還成功應(yīng)用于HeLa細(xì)胞和斑馬魚幼蟲中H2S的成像。劉彩云課題組[11]開發(fā)了一種簡單的靶向高爾基體的熒光探針5，用于跟蹤高爾基體中的H2S。探針5對H2S具有良好的選擇性和敏感性，成功用于追蹤活細(xì)胞和斑馬魚的高爾基體中H2S水平的變化。更重要的是，它可以在高爾基體特異性應(yīng)激素莫能菌素引起的高爾基體應(yīng)激反應(yīng)下實(shí)現(xiàn)H2S產(chǎn)生的原位可視化。探針5的開發(fā)有助于揭示應(yīng)激反應(yīng)中H2S的細(xì)胞保護(hù)功能。而且表明了H2S將被用作高爾基體應(yīng)激反應(yīng)的替代生物標(biāo)志物。近來，該課題組又開發(fā)了一種新型的靶向高爾基體的H2S熒光探針6，該探針的開發(fā)為研究高爾基體應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)疾病提供了一種新的化學(xué)工具。圖2 是基于疊氮基還原機(jī)理的H2S熒光探針4-6的結(jié)構(gòu)。

圖2 基于疊氮基還原機(jī)理的H2S熒光探針的結(jié)構(gòu)

2.2 H2S 的親核反應(yīng)性質(zhì)

H2S在水溶液中，主要以HS-的形式存在，其具有較強(qiáng)的親核反應(yīng)活性，容易發(fā)生親核取代和親核加成。2,4-二硝基苯基醚易于被H2S分解，基于此機(jī)制的探針越來越多的被報(bào)道。Zhao課題組[12]開發(fā)了一種新型的基于水溶性花青素的H2S熒光探針7、8。探針7、8具有快的時(shí)間響應(yīng)和良好的熒光增強(qiáng)，其中探針8在4 s內(nèi)達(dá)到飽和強(qiáng)度的一半，并在2分鐘內(nèi)完成響應(yīng)，同時(shí)熒光增強(qiáng)了115倍。因而，將探針8用于活小鼠中的H2S檢測，并證明了H2S代謝的快速。Tang課題組[13]設(shè)計(jì)并合成了一種簡單的H2S熒光探針9，探針9顯示出對H2S的高選擇性和敏感性，具有長波長發(fā)射（607 nm）、大的斯托克斯位移和良好的抗干擾能力。并在水樣、葡萄酒樣品和活細(xì)胞中評估了探針9檢測H2S 的實(shí)際適用性。而且，通過電紡絲制備的9摻雜的聚乳酸（PLA）納米纖維膜可以用于檢測H2S氣體。圖3 是基于親核反應(yīng)機(jī)理的H2S熒光探針7-9的結(jié)構(gòu)。

圖3 基于親核反應(yīng)機(jī)理的H2S熒光探針的結(jié)構(gòu)

3 SO2及其衍生物熒光探針的研究進(jìn)展

在生物體中，SO2可以由含硫氨基酸L-半胱氨酸內(nèi)生產(chǎn)生[14]，內(nèi)源性SO2可以在體內(nèi)維持生物硫和氧化還原的平衡，調(diào)節(jié)血液中的胰島素水平并降低血壓[15]。在水中，二氧化硫（SO2）轉(zhuǎn)化為亞硫酸氫根（HSO3-）和亞硫酸根陰離子（SO32-），它們與細(xì)胞、肺癌和心血管疾病中的神經(jīng)元損傷密切相關(guān)[16]。因此，亞硫酸氫根和亞硫酸根陰離子的比例感測已成為研究的重點(diǎn)。

3.1 邁克爾加成法

設(shè)計(jì)SO2衍生物的熒光探針最常用的機(jī)理方法是邁克爾加成法。吸電子基團(tuán)可以降低碳-碳雙鍵的電子密度，SO32-和HSO3-可以很容易地攻擊碳-碳雙鍵，中斷π-共軛并改變電子構(gòu)型。2018年，Hu等[17]通過邁克爾加成反應(yīng)機(jī)理開發(fā)了一種用于檢測HSO3-的新型熒光探針10，探針10對SO32-/HSO3-體現(xiàn)出高響應(yīng)速度和靈敏度 ，并可用于檢測HeLa細(xì)胞中的HSO3-。同年，Xu Jing等[18]開發(fā)了一種快速的細(xì)胞滲透的探針11，用于選擇性靈敏性檢測活細(xì)胞中的SO32-/HSO3-。更重要的是該探針具有出色的細(xì)胞滲透能力，整個(gè)細(xì)胞滲透過程只需要2 min，能更好進(jìn)行活細(xì)胞成像。Guo等[19]開發(fā)了兩種基于苯并噻唑的熒光探針12、13，用于檢測HSO3-。探針和HSO3-作用后關(guān)閉了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng)，卻開啟了激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）機(jī)制而產(chǎn)生熒光。探針12、13被成功地應(yīng)用于在A549細(xì)胞中可視外源HSO3-。

2019 年，Yan等[20]基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）機(jī)制，開發(fā)了一種新型的比率熒光探針 14用于檢測SO32-/HSO3-。探針顯示對SO32-/HSO3-快速響應(yīng)（60s內(nèi)）、良好的選擇性和高的靈敏度（檢測限28 nM）。重要的是，探針被應(yīng)用于測量實(shí)際樣品中的亞硫酸鹽水平。最近，Zhang課題組[21]設(shè)計(jì)一種易于合成的靶向線粒體的比率熒光探針15，用選擇性的檢測SO32-/HSO3-。探針15具有良好的膜通透性和較低的細(xì)胞毒性，成功用于線粒體中SO32-/HSO3-的比例檢測。圖4 是基于與醛的親核反應(yīng)的HSO3-/SO32-熒光探針10-15的結(jié)構(gòu)和機(jī)理。

圖4 基于與醛的親核反應(yīng)的HSO3- /SO32-熒光探針的結(jié)構(gòu)和機(jī)理

3.2 醛的親核加成

除上述作用機(jī)理外，基于醛的親核反應(yīng)機(jī)理設(shè)計(jì)的探針也被廣泛的應(yīng)用。2018年，唐波課題組[22]報(bào)道了一種針對HSO3-的靶向線粒體的熒光探針16。探針16在60s內(nèi)顯示出明顯的增強(qiáng)的熒光，并在HeLa細(xì)胞和斑馬魚中外源性和內(nèi)源性HSO3-成像。而且，首次在視覺上發(fā)現(xiàn)線粒體SO2與HeLa細(xì)胞的早期凋亡密切相關(guān)。

2019 年，Manoj Kumar組[23]開發(fā)出了一種新型的以醛基為反應(yīng)中心的探針17，用于檢測SO2衍生物。探針17與NaHSO3作用后，生成一個(gè)強(qiáng)氫鍵供體OH基團(tuán)。通過產(chǎn)生的分子內(nèi)氫鍵有效抑制C＝N的異構(gòu)化，進(jìn)而在545 nm處有效地增強(qiáng)了熒光。探針在PH5.5的條件下，檢測限為3.75 μM，響應(yīng)時(shí)間少于15 s，并被用于細(xì)胞和斑馬魚中成像。

同年，Zhang等[24]基于此機(jī)理設(shè)計(jì)并合成了具有雙重猝滅機(jī)制的熒光探針 18，該探針可以克服 Cys干擾，選擇性地檢測SO2。探針18與Cys的反應(yīng)會(huì)阻止內(nèi)部旋轉(zhuǎn)，保持ICT的過程，因此產(chǎn)生了較弱的熒光。與SO2的反應(yīng)有效地抑制了兩種淬滅機(jī)理，而產(chǎn)生了強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光。探針18顯示出高選擇性、高靈敏度和對SO2的快速響應(yīng)以及低細(xì)胞毒性，并成功實(shí)現(xiàn)了外源和內(nèi)源SO2的比例成像。

圖5 基于與醛的親核反應(yīng)的HSO3- /SO32-熒光探針的結(jié)構(gòu)和機(jī)理

4 總結(jié)和展望

本文總結(jié)了區(qū)分Cys/Hcy/GSH的具有多個(gè)通道的熒光探針以及H2S和SO2的熒光探針的最新進(jìn)展。盡管在該領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展，許多探針被用于生物成像，但檢測活性硫物種的設(shè)計(jì)和應(yīng)用中仍存在一些挑戰(zhàn)：1）需要開發(fā)新的傳感機(jī)制來尋找性能更好的探針；2）除了研究體外和體內(nèi)熒光成像外，還需要對生物學(xué)應(yīng)用進(jìn)行全面評估，用于與某些特定疾病相關(guān)的生物樣品的臨床測試。