呼吸道合胞病毒下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達(dá)及與Th1/Th2平衡的關(guān)系

麥朗君， 翟佳羽， 林烈桔， 符學(xué)興

(海南省儋州市人民醫(yī)院兒科， 海南 儋州 571700)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)廣泛流行于世界各地，是導(dǎo)致嬰幼兒和兒童嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎和肺炎常見(jiàn)病原體，主要表現(xiàn)為反復(fù)喘息[1,2]。但關(guān)于RSV下呼吸道感染發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，臨床癥狀與哮喘十分相似，推測(cè)其引起炎癥反應(yīng)機(jī)制與哮喘相類(lèi)似。大多數(shù)研究證明，輔助性T細(xì)胞亞群Th1/Th2的平衡失調(diào)導(dǎo)致的Th2型免疫反應(yīng)是哮喘發(fā)病關(guān)鍵[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于高度保守非編碼RNA小分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞各種代謝活動(dòng)，在疾病中發(fā)揮重要作用[4]。miRNA-145位于人類(lèi)5號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)2帶(5q32)，在多種腫瘤中表達(dá)均明顯下調(diào)[5,6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-145可以調(diào)節(jié)哮喘患者Th1/Th2平衡[7]。但是關(guān)于miR-145在RSV下呼吸道感染患兒中表達(dá)情況及其與Th1/Th2平衡間關(guān)系尚不清楚。因此本研究通過(guò)檢測(cè)RSV下呼吸道感染患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145、Th1、Th2亞群百分率等水平，以探究?jī)烧唛g關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年6月至2019年11月本院兒科建卡就診的RSV毛細(xì)支氣管炎和肺炎患兒60例為實(shí)驗(yàn)組，男性28例，女性32例，平均年齡(10.07±5.61)個(gè)月，毛細(xì)支氣管炎患兒31例，肺炎患兒29例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①急性發(fā)病，病史在一周以?xún)?nèi)；②鼻咽部脫落細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法(APAAP法)檢測(cè)RSV抗原陽(yáng)性；③無(wú)過(guò)敏性病史；④年齡≤3歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病原檢測(cè)不單一，其他病毒核酸感染；②免疫缺陷；③先天性心臟??；④支氣管或肺發(fā)育不良；⑤先天性氣道畸形；⑥過(guò)敏史或家族哮喘史。另選取同期在本院體檢健康小兒60例為對(duì)照組，男性30例，女性30例，平均年齡(10.35±5.59)個(gè)月。兩組在性別、年齡上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)儋州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有樣品采集均取得受試小兒家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2方 法

1.2.1樣品采集:患兒住院次日、健康小兒體檢當(dāng)日采集外周靜脈血4mL，取出后室溫下立即取其中1mL加入無(wú)菌肝素抗凝管(20IU/mL)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞數(shù)量；余下3mL加入無(wú)菌肝素抗凝管離心(2000r/min，離心5min)，上層取血漿，用于ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)表達(dá)水平，密度梯度離心法對(duì)外周血中單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離。將血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品置于-80℃保存，備用。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1細(xì)胞百分率、Th2細(xì)胞百分率:外周靜脈血標(biāo)本中加紅細(xì)胞裂解液靜置后離心，棄上清，得到PBMCs調(diào)PBMCs細(xì)胞，分別加入PE、FITC雙色免疫熒光雙標(biāo)記單克隆抗體及陰性對(duì)照孵育20min，PBS洗滌后，甲醛PBS固定，Attune NxT型流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)檢測(cè)，計(jì)數(shù)5000個(gè)細(xì)胞中的IL-4+、IFN-γ+陽(yáng)性細(xì)胞率。藻紅蛋白(PE)標(biāo)記大鼠抗人IL-4單抗、異硫氫酸熒光素(FITC)標(biāo)記的大鼠抗人IFN-γ單抗均購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司。

1.2.3熒光定量PCR檢測(cè)miR-145表達(dá)水平:采用RNA提取試劑盒(美國(guó)Molecular Research Center公司)提取血漿總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用CFX96型qRT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)對(duì)miR-145進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10μL：miScript SYBR Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1μL，上下游引物(10 μM)各0.5μL，ddH2O 3.0μL。反應(yīng)條件：95℃，90s；95℃，30s；63℃，30s；72℃，15s；45個(gè)循環(huán)。miR-145及內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表1。引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成；采用2-△△CT法對(duì)血清miR-145表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4酶聯(lián)免疫法測(cè)定血漿中細(xì)胞因子水平:采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血漿中IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-5水平，檢測(cè)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(IL-2、IL-4、IL-5 ELISA試劑盒均購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司，INF-γ試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。為控制檢測(cè)質(zhì)量，本次研究所有樣品的檢測(cè)均由檢驗(yàn)科同一批人員在同臺(tái)儀器上操作，每個(gè)樣本均設(shè)三次重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1各組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-145表達(dá)水平比較:實(shí)驗(yàn)組miR-145表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-145表達(dá)水平比較

2.2各組外周血Th1細(xì)胞百分率、Th2細(xì)胞百分率、Th1/Th2比值比較:實(shí)驗(yàn)組外周血Th1細(xì)胞百分率、Th1/Th2比值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組外周血Th2細(xì)胞百分率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 外周血Th1細(xì)胞 Th2細(xì)胞百分率比較

2.3各組血漿中細(xì)胞因子含量比較:實(shí)驗(yàn)組血漿中IL-2、IFN-γ表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，IL-4、IL-5表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.4實(shí)驗(yàn)組外周血miR-145表達(dá)水平、Th1/Th2比值與細(xì)胞因子相關(guān)性分析:實(shí)驗(yàn)組miR-145與IL-2、IFN-γ、Th1/Th2比值呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與IL-4、IL-5呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表4 各組血漿中細(xì)胞因子含量比較

表5 miR-145與細(xì)胞因子水平相關(guān)性分析

3 討 論

RSV是引起嬰幼兒和老年人下呼吸道感染如支氣管炎和肺炎的常見(jiàn)病原體，導(dǎo)致患者住院甚至死亡。miRNA在多種腫瘤中作用已被研究者了解，有研究表明miRNA在免疫調(diào)控中同樣扮演十分重要角色，當(dāng)其功能異常可導(dǎo)致多種免疫疾病發(fā)生[8]。目前針對(duì)miR-145研究多偏向腫瘤領(lǐng)域，而在免疫調(diào)控等研究較少[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)miR-145與免疫調(diào)控關(guān)系密切，Li等[10]研究證實(shí)老年人血清中miR-145表達(dá)上調(diào)，影響老年人免疫功能調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組miR-145表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明miR-145可能與RSV下呼吸道感染有關(guān)。Fedele等[11]研究發(fā)現(xiàn)RSV誘導(dǎo)感染引發(fā)的哮喘與Th2反應(yīng)增高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組外周血Th1細(xì)胞百分率、Th1/Th2比值顯著下降，提示與患者相關(guān)的免疫功能變化以外周血Th1/Th2比值下降為主要表現(xiàn)。

原始輔助性T細(xì)胞根據(jù)分泌細(xì)胞因子種類(lèi)不同分為T(mén)h1細(xì)胞、Th2細(xì)胞。TNF-α、IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子由Th1細(xì)胞分泌產(chǎn)生；IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子由Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生。李麗華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)霧化吸入干擾素α2b注射液治療的RSV肺炎兒童病情明顯減輕，肺泡灌洗液中IL-2含量上升，證明IL-2可能發(fā)揮抗病毒作用，減輕肺部炎癥和損傷。彭智等[13]研究表明，IL-4含量增加可能與RSV感染有關(guān)。黃燕等[14]研究發(fā)現(xiàn)RSV感染的幼齡大鼠血清中IFN-γ含量顯著降低，說(shuō)明IFN-γ在RSV下呼吸道感染中起重要作用。Mosquera等[15]國(guó)外研究表明，經(jīng)過(guò)阿奇霉素預(yù)防RSV感染的小鼠支氣管肺泡中IL-5含量顯著降低，可見(jiàn)IL-5在RSV誘導(dǎo)的下呼吸道感染中具有一定作用，與呼吸道炎癥有關(guān)。本研究顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血漿中IL-2、IFN-γ含量顯著降低，IL-4、IL-5含量顯著升高，與之前研究相似，提示RSV下呼吸道感染患兒體內(nèi)Th1相關(guān)炎癥因子水平降低，Th2相關(guān)炎癥因子水平升高。另外，實(shí)驗(yàn)組miR-145與IL-2、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，與IL-4、IL-5呈正相關(guān)，提示miR-145可能通過(guò)影響機(jī)體中Th1、Th2相關(guān)炎癥因子水平，參與RSV下呼吸道感染。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RSV下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達(dá)水平與Th1/Th2比值呈負(fù)相關(guān)，提示miR-145可能通過(guò)對(duì)輔助性T淋巴細(xì)胞Th1和Th2亞群的比例進(jìn)行調(diào)控，影響血漿中IL-2、IL-4、IFN-γ細(xì)胞炎癥因子的分泌，參與RSV下呼吸道感染過(guò)程。

綜上所述，RSV下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達(dá)上調(diào)，與Th1/Th2比例呈負(fù)相關(guān)，可能通過(guò)調(diào)控IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-5等細(xì)胞因子表達(dá)，影響RSV下呼吸道感染發(fā)生。本研究不足之處在于樣本量過(guò)少，需擴(kuò)大樣本量對(duì)RSV下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達(dá)及與Th1/Th2平衡的關(guān)系進(jìn)步一深入研究。