滇產(chǎn)兩面針中抗腫瘤活性生物堿成分研究

鄧 穎，沈曉華，鄧璐璐,3，郝小江,3，穆淑珍,3*

1貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；2貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550014

中藥兩面針為蕓香科花椒屬植物兩面針Zanthoxylumnitidum(Roxb.) DC.的干燥根[1]，其藥用部位為根，最早收載于清代趙其光所著的《本草求原》，名入地金牛，其苦、辛、平；有小毒；歸肝、胃經(jīng)[2]。主要分布于浙江、福建、臺灣、湖南、廣東、海南、廣西、四川、云南等地，生于低丘陵地灌木叢中、路旁等向陽地[3]。目前關(guān)于其化學(xué)成分的研究主要集中在印度、廣西、廣東等地產(chǎn)的中藥兩面針上，近些年從兩面針中新發(fā)現(xiàn)的次生代謝產(chǎn)物報(bào)道甚少[4]，具有抗腫瘤作用化學(xué)成分的研究也主要集中在生物堿類化合物。

黑色素瘤是臨床上發(fā)病率增長最快的惡行腫瘤之一，年增長率可達(dá)3%～5%，雖然在我國發(fā)病率較低，但近年來成倍的增長已對人民健康造成了極大的威脅。另外，黑色素瘤在我國長期以來都不被人們認(rèn)識，市面上治療黑色素瘤的方法多采用免疫治療，而對天然藥物治療的選擇并不多見。同時，對來源于兩面針中具有廣泛生物活性的生物堿研究目前主要聚焦在抑制人胃癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人腎癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞的增殖等方面，對抑制黑色素瘤的活性成分研究少見報(bào)道[5-7]。其中，白屈菜紅堿具有人胃癌，宮頸癌活性[20]，兩面針堿可抑制人口腔鱗癌細(xì)胞，人腎癌細(xì)胞[21]，鵝掌楸堿能顯著抑制人肺癌細(xì)胞的增殖[22]。另外，據(jù)報(bào)道[23]兩面針植物中部分生物堿成分對黑色素瘤細(xì)胞UACC62有較強(qiáng)的抑制活性，其中的白屈菜紅堿能有效抑制黑色素瘤細(xì)胞B16的增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，且顯著升高半胱氨酸蛋白酶-3和Bax的基因表達(dá)水平，降低Bcl-2基因表達(dá)水平，該作用與抑制Wnt/β-catenim 信號通路的激活有關(guān)[24]?？梢姡瑑擅驷樦参镏锌赡艽嬖跐撛诘目购谏亓鏊幬锵葘?dǎo)化合物。

因此，為了尋找一種活性顯著，毒性低的創(chuàng)新型抗黑色素瘤藥物，前期對滇產(chǎn)兩面針根部乙醇提取物的不同萃取部位進(jìn)行了活性追蹤，發(fā)現(xiàn)石油醚萃取部位和氯仿萃取部位對黑色素瘤細(xì)胞株WM9的增殖具有明顯的抑制作用，這對探索滇產(chǎn)兩面針中抗黑色素瘤活性成分具有很重要的引導(dǎo)作用，為創(chuàng)新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。為此，本文針對滇產(chǎn)兩面針根部乙醇提取物的石油醚萃取部位和氯仿萃取部位中的生物堿成分進(jìn)行了分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定，并測試其對黑色素瘤細(xì)胞WM9增殖的抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

滇產(chǎn)兩面針采集于云南省西雙版納州勐臘縣，經(jīng)中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園肖春芬教授鑒定為兩面針(Zanthoxylumnitidum(Roxb.) DC.)，原植物標(biāo)本(20140408)現(xiàn)存于貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑

恒溫振蕩器HZQ-F160A(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS(上海申安醫(yī)療器械廠);SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);電子天平FA2204B(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司);INOVA-400 MHz核磁共振波譜儀;Bruker AM-400和DRC-100核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司);Sephadex LH-20凝膠(40～70 μm，瑞士Amershan Pharmacia Biotech AB公司);柱層析硅膠(200～300目和300～400目);硅膠H(10～40 μm)和薄層層析用硅膠GF254(0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠)。

本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純試劑，二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇(分析純，上海泰坦科技股份有限公司)和氯仿(工業(yè)級，使用前經(jīng)重蒸處理)，其余試劑為國產(chǎn)分析純。黑色素瘤細(xì)胞WM9購于ATCC公司;阿霉素購于索萊寶公司;培養(yǎng)液：DMEM(Gibco，C11995500CP);胎牛血清(Bio IND，04-002-1A);Antibiotic-Antimycotic(Lifetechnologies，15240-112);MTT(四噻唑藍(lán)：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 提取與分離

取滇產(chǎn)兩面針干燥根，粉碎后稱重，得20 kg。隨后用50 升95%乙醇在60 ℃下加熱回流提取三次，每次時間分別為4、3、2 h，過濾藥渣，合并提取液，濃縮乙醇至無醇味，得浸膏。浸膏依次用石油醚，氯仿，正丁醇等體積萃取三次，將萃取物減壓濃縮得到石油醚萃取部位180.1 g和氯仿萃取部位190.6 g。石油醚萃取部位用乙酸乙酯溶解后經(jīng)300 g正相柱硅膠(200～300 目)拌樣，然后用3 000 g正相柱硅膠(200～300目)濕法裝柱，采用干法上樣，進(jìn)行柱層析色譜分離，用石油醚∶乙酸乙酯體系(15∶1→ 0∶1)進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr.1～7。Fr.6經(jīng)硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱色譜交替使用后，用石油醚∶乙酸乙酯混合溶劑(4∶1)，經(jīng)減壓硅膠柱層析洗脫，得到化合物9(30 mg)。Fr.5(3 g)經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇=150∶1混合溶劑洗脫后，重結(jié)晶(氯仿∶甲醇)得到化合物4(1.3 g)。氯仿萃取部位用氯仿溶解后用400 g正相柱硅膠(200～300目)拌樣，3 000 g正相柱硅膠(200～300目)濕法裝柱，采用干法上樣，進(jìn)行柱層析色譜分離，用氯仿∶甲醇混合溶劑(100∶1→0∶100)梯度洗脫，得到Fr.1～9。Fr.4經(jīng)硅膠柱層析(300～400目)和Sephadex LH-20凝膠柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)反復(fù)使用后，用氯仿∶甲醇=100∶1混合溶劑經(jīng)減壓硅膠柱層析洗脫，得到化合物12(360 mg)。Fr.6經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇體系(150∶1→1∶40)梯度洗脫，得到Fr.6.1～6.8，F(xiàn)r.6.3(600 mg)運(yùn)用反相硅膠柱層析(RP-18，甲醇∶水=50∶50→90∶10)洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)洗脫，得到化合物3(11 mg)；Fr.6.4經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇體系(150∶1)洗脫后，運(yùn)用減壓硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺=100∶1)洗脫，得到化合物5(30 mg)；Fr.6.6經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)洗脫，得到化合物7(7 mg)。Fr.7經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇=100∶1混合溶劑洗脫，得到Fr.7.1～7.4，F(xiàn)r.7.1經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇=150∶1混合溶劑洗脫后，重結(jié)晶(氯仿∶甲醇)得到化合物10(460 mg)；Fr.7.2用Sephadex LH-20凝膠柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)洗脫后，再經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=20∶1)洗脫，重結(jié)晶(氯仿∶甲醇)得到化合物1(5 mg)；Fr.7.3經(jīng)減壓硅膠柱層析(石油醚∶二乙胺=40∶1)洗脫得到化合物2(3 mg)，經(jīng)正相硅膠柱層析(氯仿∶甲醇=120∶1)得到化合物11(16 mg)；Fr.7.4用Sephadex LH-20凝膠柱層析洗脫(氯仿∶甲醇=1∶1)后，再經(jīng)反相硅膠柱層析(RP-18，甲醇-水)洗脫，重結(jié)晶(氯仿∶甲醇)得到化合物6(8 mg)；Fr.7.4.2經(jīng)正相硅膠柱層析，用氯仿∶甲醇=80∶1混合溶劑洗脫，得到化合物8(6 mg)。

1.4 抗腫瘤活性檢測

采用MTT法測定化合物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。分別取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞WM9消化，得到細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，按照計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個/mL，以每孔190 μL分別接種于96孔板中，在5% CO2，37 ℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，再分別加入10 μL陽性對照(阿霉素)以及不同濃度的12個化合物樣品(每個化合物設(shè)置5個濃度梯度，分別為40、20、10、5、2.5和1.25 μM)加入到96孔板中，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，于5% CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后。最后加入20 μL稀釋好的MTT到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出96孔板于離心機(jī)上離心(2 500 rpm，25 min)，用移液槍吸去上清液后，每孔加入DMSO 160 μL，在搖床上震動搖勻(160 rpm，10 min)，用酶標(biāo)儀在波長490 nm 下測定其吸光度A，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。最后Craphad prism 5.0計(jì)算樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)解析

化合物1～12的結(jié)構(gòu)如圖1所示(*標(biāo)示的是新化合物)。

圖1 滇產(chǎn)兩面針根中化合物的結(jié)構(gòu)(1～12)Fig.1 Structures of compounds 1-12 from the roots of Z.nitidum

化合物1橘黃色固體，ESI-MS：m/z341 [M + Na]+；對改良碘化鉍鉀顯色劑呈陽性反應(yīng)，推測為含氮生物堿類化合物。根據(jù)1H NMR、13C NMR和DEPT譜可知該化合物有16個氫信號，20個碳信號，分別為C×9，CH×8，OCH2O×1，NCH3×1以及OCH3×1，根據(jù)以上核磁數(shù)據(jù)并結(jié)合質(zhì)譜信息可確定其分子式為C20H16NO3。通過對其1H NMR(如表1所示)的分析，可見結(jié)構(gòu)中存在三個芳香質(zhì)子信號δ8.12(1H，s，H-4)，7.61(1H，d，J=1.2，H-7)和7.54(1H，s，H-1)；兩對苯環(huán)鄰位耦合的質(zhì)子信號δ8.20(1H，dd，J=8.9，1.2 Hz，H-9)和8.59(1H，d，J=8.9 Hz，H-10)，8.51(1H，d，J=9.1 Hz，H-11)和7.99(1H，d，J=9.1 Hz，H-12)；一個亞甲二氧基質(zhì)子信號δ6.29(2H，s，H-13)；一個氮甲基質(zhì)子信號δ5.03(3H，s，-NCH3)；一個甲氧基質(zhì)子信號δ4.30(3H，s，8-OCH3)；單峰的質(zhì)子信號δ9.90(1H，s，H-6)。以上核磁數(shù)據(jù)顯示化合物1應(yīng)該是一個苯駢菲啶型生物堿[8]。

表1 化合物1的1H(400 MHz)和13C(100 MHz)NMR的核磁數(shù)據(jù)(CDCl3∶CD3OD=2∶1)

經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，化合物1與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的化合物6(兩面針堿)的核磁數(shù)據(jù)差別不大，主要的區(qū)別在于化合物1中C-9位的碳信號δC為131.8 ppm時，化合物6的C-9位的碳信號δC是127.8 ppm，并且化合物1比化合物6少一個甲氧基，而其他位置的碳信號基本一致。根據(jù)HSQC譜進(jìn)一步分析可知，δH(8.20，dd，J=8.9，1.2，H-9)與δC(131.8，C-9)相關(guān)，表明C-9位含有一個氫質(zhì)子，另外由HMBC相關(guān)譜(如圖2所示)可知，H-9(δH8.20)與C-7(δC126.9)和C-10a(δC120.8)相關(guān)，H-10(δH8.59)與C-9(δC131.8)相關(guān)，由此可確定少的甲氧基在C-9位上；H-7(δH7.61)與C-6(δC150.2)和C-10a(δC120.8)相關(guān)，H-6(δH9.90)與C-6a(δC129.2)，C-7(δC126.9)和N-CH3(δC62.3)相關(guān)，由此可知C-7位不含甲氧基。綜上所述可鑒定化合物1為9-去甲氧基兩面針堿，經(jīng)查Scifinder數(shù)據(jù)庫確認(rèn)該化合物為一個新結(jié)構(gòu)化合物。

圖2 化合物1的HMBC相關(guān)譜和化合物6的結(jié)構(gòu)Fig.2 HMBC correlation spectrum of compound 1 and structure of compound 6

化合物2紅色粉末，ESI-MS：m/z336 [M + H]+；對改良碘化鉍鉀顯色劑呈陽性反應(yīng)，推測為含氮生物堿類化合物。1H NMR、13C NMR和DEPT譜可知該化合物有17個氫信號，20個碳信號，分別為C×9，CH×8，OCH2O×1，NCH3×1以及OCH3×1，根據(jù)以上核磁數(shù)據(jù)可以確定其分子式為C20H17NO4。由1H NMR(如表2所示)譜分析，可見三個芳香質(zhì)子信號δ7.12(1H，s，H-1)，7.68(1H，s，H-4)和7.43(1H，d，J=4.9 Hz，H-8)；兩對苯環(huán)鄰位耦合的質(zhì)子信號δ7.74(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)和7.47(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，7.04(1H，d，J=8.5 Hz，H-9)和7.55(1H，d，J=8.5 Hz，H-10)；一個亞甲二氧基質(zhì)子信號δ6.07(2H，s，H-13)；一個甲氧基質(zhì)子信號δ3.96(3H，s，7-OCH3)；氮甲基質(zhì)子信號δ2.76(3H，s，N-CH3)；一個單峰的質(zhì)子信號δ5.52(1H，s，H-6)。以上核磁數(shù)據(jù)顯示化合物2應(yīng)該是二氫苯駢菲啶型生物堿[9]。

表2 化合物2的1H(400 MHz)和13C(100 MHz)NMR的核磁數(shù)據(jù)(CDCl3)

根據(jù)1H NMR和13C NMR(如表2所示)數(shù)據(jù)分析，化合物2(圖3)和文獻(xiàn)[10]中的已知化合物2′(buesgenine)相似(見圖3)，除了C-8，C-9的碳信號不同外，其他碳信號基本一致。由1H NMR數(shù)據(jù)可知化合物2比化合物2′多了一個芳香質(zhì)子信號δH(7.43，d，J=4.9 Hz，H-8)，分子量少了16，推測可能少一個酚羥基。根據(jù)HMBC相關(guān)譜(如圖3所示)進(jìn)一步分析可知，H-8(δH7.43)與C-6a(δC144.9)，C-10a(δC122.4)和C-7(δC148.9)相關(guān)，由此可推測C-8位上沒有取代基。另外，由于C-8缺少一個羥基，導(dǎo)致化合物2中C-9(δC117.0)位的碳信號向高場偏移3個化學(xué)位移值。綜上所述可鑒定化合物2為8-dehydroxyl-buesgenine，經(jīng)查Scifinder數(shù)據(jù)庫確認(rèn)該化合物為一個新結(jié)構(gòu)化合物。化合物1和2的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

圖3 化合物2的HMBC相關(guān)譜和化合物2′的結(jié)構(gòu)Fig.3 HMBC correlation spectrum of compound 2 and structure of compound 2′

化合物3淡黃色粉末(CHCl3);ESI-MS：m/z380 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.69(1H，d，J=6.8 Hz，H-11)，7.64(1H，s，H-4)，7.52(1H，d，J=6.8 Hz，H-12)，7.34(1H，s，H-10)，7.13(1H，s，H-1)，6.80(1H，s，H-7)，6.06(2H，s，H-13)，4.14(1H，m，H-6)，4.00(3H，s，8-OCH3)，3.96(3H，s，9-OCH3)，3.45(1H，m，H14-a)，3.15(1H，m，H14-b)，2.74(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：149.0(C-8)，149.0(C-9)，148.5(C-3)，147.5(C-2)，137.8(C-4b)，131.0(C-12a)，127.0(C-4a)，124.3(C-10a)，124.3(C-12)，124.0(C-6a)，123.4(C-10b)，119.5(C-11)，110.5(C-7)，106.3(C-10)，104.6(C-1)，101.1(C-13)，99.8(C-4)，65.3(C-6)，62.8(C-14)，56.1(8-OCH3)，56.0(9-OCH3)，42.7(N-CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定化合物3為6β-hydroxymenthyldihydronitidine。

化合物4無色固體(CHCl3);ESI-MS：m/z320 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：9.61(1H，s，H-6)，8.57(1H，s，H-4)，8.33(1H，d，J=8.4 Hz，H-11)，8.29(1H，d，J=9.2 Hz，H-7)，7.83(1H，d，J=8.4 Hz，H-12)，7.53(1H，d，J=9.2 Hz，H-8)，7.25(1H，s，H-1)，6.12(2H，s，H-13)，4.11(3H，s，10-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：149.1(C-9)，148.7(C-3)，147.7(C-2)，146.3(C-6)，143.1(C-10)，139.7(C-4b)，130.2(C-12a)，129.2(C-4a)，128.2(C-6a)，127.6(C-12)，123.8(C-11)，122.3(C-10a)，121.2(C-10b)，119.1(C-8)，118.6(C-7)，104.9(C-1)，102.0(C-4)，101.8(C-13)，62.1(10-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]中報(bào)道的花椒木精波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4為花椒木精。

化合物5棕色固體(CHCl3);ESI-MS：m/z386 [M + Na]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.98(1H，d，J=6.8 Hz，H-11)，7.92(1H，s，H-7)，7.63(1H，s，H-4)，7.58(1H，s，H-10)，7.55(1H，d，J=6.8 Hz，H-12)，7.18(1H，s，H-1)，6.11(2H，s，H-13)，4.11(3H，s，6-OCH3)，4.06(3H，s，8-OCH3)，3.98(3H，s，9-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：164.3(C-6)，153.4(C-9)，149.6(C-8)，147.4(C-2)，147.0(C-3)，135.8(C-4b)，131.8(C-12a)，128.9(C-10a)，123.2(C-12)，121.0(C-4a)，119.0(C-6a)，118.3(C-11)，116.6(C-10b)，108.5(C-7)，104.7(C-1)，102.7(C-10)，102.6(C-4)，101.5(C-13)，56.2(6-OCH3)，56.1(8-OCH3)，41.2(9-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]中報(bào)道的rhoifoline B波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物5為rhoifoline B。

化合物6黃色粉末(CHCl3);ESI-MS：m/z349 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：9.68(1H，s，H-6)，8.19(1H，d，J=9.1 Hz，H-12)，8.60(1H，d，J=9.1 Hz，H-11)，8.17(1H，s，H-10)，8.14(1H，s，H-4)，7.81(1H，s，H-7)，7.54(1H， s，H-1)，6.30(2H，s，H-13)，4.96(3H，s，N-CH3)，4.31(3H，s，9-OCH3)，4.16(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：150.8(C-8)，150.4(C-6)，149.8(C-2)，149.1(C-3)，127.8(C-9)，133.6(C-12a)，133.1(C-4b)，132.4(C-12)，130.0(C-6a)，126.6(C-7)，146.1(C-10b)，121.0(C-4a)，120.2(C-10a)，119.3(C-11)，118.9(C-5)，106.5(C-1)，104.3(C-4)，103.2(C-13)，52.8(8-OCH3)， 53.1(9-OCH3)，60.9(N-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]中報(bào)道的兩面針堿波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物6為兩面針堿。

化合物7黃色粉末(CHCl3);ESI-MS：m/z349 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：10.00(1H，s，H-6)，8.65(1H，d，J=9.2 Hz，H-11)，8.62(1H，d，J=8.9 Hz， H-10)，8.23(1H，d，J=8.9 Hz，H-9)，8.18(1H，d，J=9.2 Hz，H-12)，8.13(1H，s，H-4)，7.54(1H，s，H-1)，6.30(2H，s，H-13)，5.04(3H，s，N-CH3)，4.34(3H，s，8-OCH3)，4.17(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：151.3(C-8)，150.6(C-6)，150.4(C-2)，150.2(C-3)，146.8(C-7)，133.6(C-12a)，132.8(C-4b)，132.4(C-12)，129.5(C-6a)，127.0(C-9)，126.7(C-10b)，121.0(C-4a)，120.2(C-10a)，119.3(C-11)，118.9(C-5)，106.9(C-1)，104.4(C-4)，103.6(C-13)，52.7(8-OCH3)，57.4(7-OCH3)，62.3(N-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]中報(bào)道的白屈菜紅堿波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物7為白屈菜紅堿。

化合物8無色固體(CHCl3);ESI-MS：m/z380 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.70(1H，d，J=8.4 Hz，H-11)，7.65(1H，s，H-4)，7.55(1H，d，J=8.4 Hz，H-10)，7.50(1H，d，J=8.4 Hz，H-12)，7.12(1H，s，H-1)，6.97(1H，d，J=8.4 Hz，H-9)，6.06(2H，s，H-13)，4.67(1H，dd，J=10.4，4.8 Hz，H-6)，3.95(3H，s，7-OCH3)，3.93(3H，s，8-OCH3)，3.49(1H，t，J=10.4，4.8 Hz，H14-a)，3.10(1H，t，J=10.4，4.8 Hz，H14-b)，2.74(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：152.2(C-8)，148.4(C-3)，147.5(C-2)，146.4(C-7)，137.8(C-4b)，131.0(C-12a)，127.0(C-4a)，125.8(C-6a)，125.1(C-10a)，124.3(C-12)，123.4(C-10b)，119.8(C-11)，118.9(C-10)，111.8(C-9)，104.6(C-1)，101.1(C-13)，99.8(C-4)，61.9(6-CH2OH)，61.2(7-OCH3)，55.8(8-OCH3)，42.9(N-CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14,15]中報(bào)道的博落回醇堿波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物8為博落回醇堿。

化合物9無色固體(CHCl3);ESI-MS：m/z200 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.29(1H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-5)，8.01(1H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-8)，7.69(1H，m，H-7)，7.46(1H，m，H-6)，7.64(1H，d，J=2.7 Hz，H-α)，7.10(1H，d，J=2.7 Hz，H-β)，4.47(3H，s，4-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：145.6(C-10)，143.6(C-8)，129.6(C-7)，127.8(C-α)，123.7(C-6)，122.3(C-5)，118.7(C-3)，104.7(C-β)，103.4(C-9)，59.0(4-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]中報(bào)道的白鮮堿波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物9為白鮮堿。

化合物10淡黃色粉末(CHCl3);ESI-MS：m/z230 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.74(1H，dd，J=8.6，1.2 Hz，H-5)，7.32(1H，dd，J=8.6，7.6 Hz，H-6)，7.28(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz，H-7)，7.78(1H，d，J=2.8 Hz，H-α)，7.12(1H，d，J=2.8 Hz，H-β)，4.40(3H，s，4-OCH3)，4.07(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：163.0(C-4)，156.7(C-8)，154.3(C-2)，143.7(C-α)，137.3(C-9)，123.2(C-6)，119.4(C-10)，113.9(C-5)，107.5(C-β)，104.4(C-7)，103.6(C-3)，58.8(4-OCH3)，55.8(8-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]中報(bào)道的γ-崖椒堿波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物10為γ-崖椒堿。

化合物11淡黃色固體(CHCl3);ESI-MS：m/z260 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.00(1H，d，J=9.2 Hz，H-5)，7.57(1H，d，J=2.8 Hz，H-α)，7.23(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)，7.03(1H，d，J=2.8 Hz，H-β)，4.48(3H，s，4-OCH3)，4.12(3H，s，7-OCH3)，4.03(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：164.3(C-2)，157.2(C-4)，152.1(C-10)，143.0(C-α)，141.8(C-7)，141.3(C-8)，118.2(C-5)，114.8(C-3)，112.0(C-6)，104.6(C-β)，102.0(C-9)，61.6(8-OCH3)，59.0(4-OCH3)，56.7(7-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]中報(bào)道的茵芋堿波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物11為茵芋堿。

化合物12黃色粉末(CHCl3);ESI-MS：m/z276 [M + H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3/CD3OD)δ：8.63(1H，d，J=5.2 Hz，H-5)，7.61(1H，d，J=5.2 Hz，H-4)，8.33(1H，dd，J=8.1，7.6 Hz，H-11)，8.27(1H，dd，J=8.1，7.6 Hz，H-8)，7.57(1H，m，H-10)，7.45(1H，m，H-9)，6.92(1H，s，H-3)，6.28(2H，s，-O-CH2-O-)；13C NMR(100 MHz，CDCl3/CD3OD)δ：182.5(C-7)，152.2(C-2)，148.6(C-1)，144.4(C-3a)，144.2(C-5)，136.1(C-6a)，134.4(C-10)，132.9(C-11a)，130.8(C-7a)，128.6(C-9)，128.4(C-8)，127.5(C-11)，125.0(C-4)，123.1(C-4a)，107.4(C-1a)，103.4(C-3)，103.2(-OCH2O-)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]中報(bào)道的鵝掌楸堿波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物12為鵝掌楸堿。

2.2 抗腫瘤活性評價

采用MTT法測定了化合物1～12對黑色素瘤WM9細(xì)胞株增殖的抑制作用，結(jié)果見表3。與阿霉素相比，化合物3、5、6、7和12對WM9細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，IC50分別為1.936、21.890、0.880、6.681和12.370 μM。其中化合物3(1.936 μM)和6(0.880 μM)對WM9細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。

表3 化合物1～12對黑色素瘤WM9細(xì)胞的IC50值

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從滇產(chǎn)兩面針根莖的95%乙醇提取物的石油醚和氯仿萃取部位分離純化，并通過一維和二維核磁數(shù)據(jù)鑒定了12個化合物的結(jié)構(gòu)，其中化合物1～8為苯駢菲啶類，化合物9～11為呋喃喹啉類，化合物12為阿樸菲類，且化合物1和2為新化合物。此外對所有化合物首次進(jìn)行了黑色素瘤細(xì)胞增殖的抑制作用研究，研究表明化合物3、5、6、7和12對WM9細(xì)胞均展現(xiàn)出較好的抑制活性，其中化合物3(IC50=1.936 μM)和6(IC50=0.880 μM)對WM9細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。綜合分析發(fā)現(xiàn)，活性較好的化合物均為苯駢菲啶類，這為苯駢菲啶類化合物的生物活性研究提供了一定的價值和意義；另外，在活性較強(qiáng)的化合物3和6中，因文獻(xiàn)報(bào)道[19]化合物6具有一定的毒性，后續(xù)可從化合物3出發(fā)，進(jìn)一步深入探討其藥理作用和構(gòu)效關(guān)系，為尋找低毒高效的抗黑色素瘤細(xì)胞的藥物分子提供物質(zhì)基礎(chǔ)。黑色素瘤是臨床上發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，它極大的威脅著人們的健康，由于我國對治療黑色素瘤的天然藥物研究并不多見，這為發(fā)現(xiàn)新型天然抗黑色素瘤的藥物提供了研究思路。本研究不僅豐富了兩面針的化學(xué)成分及藥理活性研究，還對尋找低毒高效的苯駢菲啶類化合物的抗黑色素瘤細(xì)胞生物活性和構(gòu)效關(guān)系研究提供了研究依據(jù)，為滇產(chǎn)兩面針進(jìn)一步的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。