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    不同干燥方式對當歸性狀、顯微形態(tài)、活性成分含量和抗氧化物酶活性的影響

    2020-08-31 03:45:48荔淑楠王引權馬麗麗李淑琪傅金魁
    天然產物研究與開發(fā) 2020年8期

    荔淑楠,王引權,2*,馬麗麗,李淑琪,傅金魁,樊 秦,彭 桐

    1甘肅中醫(yī)藥大學;2甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室培育基地,蘭州 730000;3北京華珍烘烤系統設備工程有限公司工藝部,北京 100029

    當歸為臨床常用的大宗中藥材之一,具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功效。用于血虛萎黃、眩暈心悸、月經不調、經閉痛經、虛寒腹痛、腸燥便秘、風濕痹痛、跌撲損傷、癰疽瘡瘍[1]。甘肅為當歸道地產區(qū),種植歷史悠久、地區(qū)集中。甘肅當歸栽培面積約占全國70%,年產量占全國90%[2,3]。新鮮當歸含有大量有機酸、多糖、苯酞類化合物及其他次生代謝產物,具有熱敏性、揮發(fā)性、染菌性、高水分、易質變等特征[4]。干燥是中藥材生產過程中最普遍、最關鍵的加工環(huán)節(jié)。干燥起到殺菌抑菌、改善外觀品質、延長儲存期、減少運輸質量及便于后續(xù)切片加工等作用[5]。目前當歸產區(qū)普遍采用曬干、陰干和熏干等傳統方式[6]。傳統干燥方式存在著規(guī)模小散、技術裝備落后、干燥過程難控、干燥周期較長等問題,常造成藥材性味劣變、活性成分(特別是藥用有效成分)損失,導致用藥安全性和有效性下降。且加工費時耗力,易引起環(huán)境污染等問題。因此,研究規(guī)?;⒓s化、智能化的當歸產地干燥加工技術勢在必行。近年來,平衡脫水干燥技術已在河南焦作的山藥、牛膝,安徽亳州的白芍,甘肅隴西的當歸、黃芪、甘草等大宗藥材的產地干燥加工中實現了產業(yè)化應用。課題組前期在龍腦樟葉片干燥中也做過研究,初步證實平衡脫水干燥技術亦適宜于龍腦樟葉片干燥[7]。平衡脫水干燥的核心技術是在建立不同物料理論干燥曲線的基礎上,通過智能化控制系統在線精準調控不同干燥階段溫度、濕度和時間三要素,有的放矢地調控脫水速率,使物料內外均衡脫水,進而保障干燥產品的高質化和穩(wěn)定化。盡管平衡脫水技術已在甘肅當歸產地加工中規(guī)?;瘧?,但目前就其對當歸藥材外觀性狀、顯微形態(tài)、活性成分含量及抗氧化酶活性等的影響仍缺乏系統研究。本研究將通過比較平衡脫水、曬干、陰干及熏干等4種干燥方式對當歸藥材外觀和內在品質的綜合影響,探究干燥過程中的抗氧化生理機制,以期為當歸道地產區(qū)產地干燥加工新技術的引進與推廣,體現當歸藥材的“優(yōu)形、優(yōu)質”,最終實現藥用的“優(yōu)效”而提供科學依據。

    1 實驗材料

    供試新鮮當歸產自道地產區(qū)的甘肅岷縣,品種為“岷歸1號”。待干燥處理的新鮮當歸為大小相近、無腐爛、無機械損傷、無病蟲害的全根,初始含水量為72.87%。

    對照品為:阿魏酸(批號H27J7L16718)、洋川芎內酯I(批號P02F9F54166)、洋川芎內酯H(批號P02F9F54165)、洋川芎內酯A(批號P23A9F68613)、正丁基苯酞(批號S09J9D65229)、藁本內酯(批號Y17S9L70462)、歐當歸內酯A(批號P24A9S68617)、阿魏酸松柏酯(批號Z24D9B78131)均來源于上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%;葡萄糖(SG8510,北京索萊寶科技有限公司);Sigma-alorich甲醇(批號WXBB6450V,HPLC≥99.9%);Sigma-alorich乙腈(批號WXBB6406V,HPLC≥99.9%);冰乙酸(批號20180801,分析純,天津大茂化學試劑公司);苯酚(批號20160729,國藥集團化學試劑有限公司);水合氯醛(中國醫(yī)藥集團上?;瘜W工業(yè)公司)。總蛋白(TP)測定試劑盒(帶標準:考馬斯亮藍法)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(分光光度法)、過氧化物酶(POD)測定試劑盒(測植物)(比色法)均來自南京建成生物工程研究所。

    試驗用設備:智能平衡脫水烘房(SY-4,北京華珍烘烤系統設備工程有限公司);系統顯微鏡(BX51-31X01,日本奧林巴斯TM);高效液相色譜儀(Agilent1100,美國);電子分析天平(BT125D,賽多利斯科學儀器北京有限公司);超純水系統(Smart-N15VF,力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);數控超聲波清洗器(KH-500DE,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);Benchmark Plus酶標儀(美國BIO-RAD);SCIENTZ-48高通量組織研磨器(Scientz-48,寧波新芝生物科技股份有限公司)。

    2 實驗方法

    2.1 干燥處理

    試驗設4種干燥方式,即平衡脫水干燥、熏干、曬干和陰干。重復3次。平衡脫水干燥在北京華珍烘烤系統設備工程有限公司工藝部按照預試驗優(yōu)化的工藝流程進行。熏干、曬干和陰干均在甘肅岷縣當地按照道地產區(qū)按傳統干燥工藝干燥。當歸不同干燥處理方式的流程與參數見表1。

    表1 當歸干燥處理方式及參數

    2.2 評價方法

    2.2.1 性狀鑒別

    按照中藥鑒定學常規(guī)鑒定方法,從形狀、大小、顏色、表面特征、斷面、質地、氣味等方面進行評價。

    2.2.2 顯微鑒別

    采用徒手切片法。將大小均勻的當歸歸身橫切成薄片,滴加番紅染液封片,置顯微鏡下觀察并拍照。在20倍鏡下隨機選取15個油室,用顯微鏡自帶標尺測量其直徑。采用常規(guī)粉末制片法,用 Olympus BX51-31X01 型系統顯微鏡觀察具體特征。

    2.2.3 活性物質含量測定

    2.2.3.1 浸出物、揮發(fā)油提取率及多糖含量測定

    浸出物和揮發(fā)油含量按2015年版《中國藥典》方法測定。多糖含量采用苯酚硫酸法[6,8]。重復3次,取平均值作為結果。

    2.2.3.2 薄層色譜分析

    參照2015版《中國藥典》第一部測定[1]。

    2.2.3.3 阿魏酸和7種苯酞類成分測定

    采用高效液相色譜法[9,10]:以Merk RP-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)對其進行分離,流動相為1%乙酸(A):乙腈(B),梯度洗脫:18 min,19.0% B;60 min,100% B;75 min,100% B;檢測波長280 nm;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量20 μL。

    2.2.3.4 混合對照品溶液的制備

    取對照品阿魏酸1.54 mg,藁本內酯5.56 mg,洋川芎內酯A 3.20 mg,洋川芎內酯I 0.58 mg,洋川芎內酯H 0.20 mg,歐當歸內酯A 1.10 mg,正丁基苯酞5.05 mg,阿魏酸松柏酯0.27 mg,精密稱定,分別置于5 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至5 mL,得對照品貯備液分別精密各貯備液0.5 mL至5 mL容量瓶中,用甲醇定容至5 mL,得混合對照品溶液,然后精密吸取上述制得的混合對照品溶液各1.4、1.0、0.6、0.2、0.1 mL,分別用甲醇定容至2 mL容量瓶中,得質量濃度不同的混合對照品溶液,以上對照品均置于4 ℃冰箱保存,備用。

    2.2.3.5 供試品溶液的制備

    取當歸粉末3份(過3號篩),每份約0.5 g,精密稱定,置于150 mL磨口具塞錐形瓶中,加入70%甲醇溶液20 mL后稱重,用保鮮膜蓋嚴,在220 W,80 Hz條件下超聲40 min,再稱重,用70%甲醇補足失重,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜過率,取續(xù)濾液,即得。對照品及供試品溶液的色譜圖見圖1。

    圖1 4不同干燥方式當歸的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of CA by different drying methods注:S1.空白試劑;S2.混合對照品;S.曬干;X.熏干;Y.陰干;P.平衡脫水干燥;1.阿魏酸;2.洋川芎內酯I;3.洋川芎內酯H;4.阿魏酸松柏酯;5.洋川芎內酯A;6.正丁基苯酞;7.藁本內酯;8.歐當歸內酯A。Note:S1.Blankreagent;S2.Mixed reference substance;S.Sun-dried CA;X.Fumed CA;Y.Shade-drying CA;P.Drying process on Balance dehydration of CA;1.Ferulic acid;2.Senkyunolide I;3.Senkyunolide H;4.Coniferyl ferulate;5.Senkyunolide A;6.n-Butyl phthalide;7.(Z)-Ligustilide;8.Levistolide A.

    2.2.3.6 線性關系考察

    按“2.2.3.3”項下色譜條件進行測定,每個濃度進樣3次,取平均值。以進樣量(X)為橫坐標,平均色譜峰面積(Y)為縱坐標,分別繪制標準曲線,得回歸方程。阿魏酸:Y=14.082X-32.553(r=0.999 9),在0.003 1~0.308 0 mg/mL范圍內線性關系良好;洋川芎內酯I:Y=70 075X-53.795(r=0.999 6),在0.001 2~0.011 6 mg/mL范圍內線性關系良好;洋川芎內酯H:Y=89 289X-14.828(r=0.999 8),在0.000 4~0.004 0 mg/mL范圍內線性關系良好;阿魏酸松柏酯:Y=33 984X+1.656 2(r=0.999 9),在0.000 5~0.054 0 mg/mL范圍內線性關系良好;洋川芎內酯A:Y=8 270.8X+6.568 8(r=0.999 7),在0.003 2~0.064 0 mg/mL范圍內線性關系良好;正丁基苯酞:Y=8 833X-2.747 4(r=0.999 8),在0.005 05~0.101 0 mg/mL范圍內線性關系良好;藁本內酯:Y=23 451X+16.729(r=0.999 6),在0.003 9~1.112 0 mg/mL范圍內線性關系良好;歐當歸內酯A:Y=56 521X-6.774 5(r=0.999 8),在0.001 1~0.022 0 mg/mL范圍內線性關系良好。

    2.2.4 抗氧化活性測定

    取當歸粉末(過3號篩)3份,每份約0.2 g,精密稱定,置于研缽中,加3.0 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液,加入少量石英砂,置SCIENTZ-48高通量組織研磨器中快速研磨,過濾,在4 ℃,3500 rpm條件下離心10 min,取上清液于4 ℃冰箱中保存,供抗氧化酶活性測定??扇苄缘鞍撞捎每捡R斯亮藍G-250法測定;當歸SOD、POD、CAT等酶活性和GSH含量均按南京建成生物工程研究所提供的酶聯免疫法(ELISA)法試劑盒方法測定。所有測定均重復3次。

    2.3 數據處理

    3 結果與分析

    3.1 性狀鑒別

    由圖2和表2可以看出,4種干燥方式處理下的當歸性狀存在明顯差異。相同點在于大小相近、質地多脆。不同點在于:P的當歸色澤均勻鮮亮、表面皺紋較疏松,而X、S、Y的當歸色澤不均勻、表面皺紋致密。X與P的斷面棕色點狀分泌腔明顯,皮部油樣光澤不明顯,而S與Y與之相反。X和S的香氣較濃郁,Y的次之,P的較淡。P有較強的麻舌感。

    圖2 不同干燥方式當歸性狀比較Fig.2 Character comparison in CA by different drying methods

    表2 不同干燥方式當歸藥材性狀的差異

    3.2 顯微特征

    3.2.1 油室

    油室直徑大小能間接反映當歸揮發(fā)油的含量[11]。從圖3看出,不同干燥方式下當歸油室的平均直徑P(119.1 μm)>X(113.3 μm)>S(104.2 μm)>Y(89.7 μm)。P的油室直徑比X高5.11%,比S高14.33%,比Y高32.82%,表明P對當歸揮發(fā)油保存較好。

    3.2.2 薄壁細胞內含淀粉粒

    由圖4看出,P與X下當歸的淀粉粒密度較高,且與S和Y的差異明顯。淀粉粒為當歸薄壁細胞富含的營養(yǎng)物質[12],因此,從淀粉粒含量可以反映出P與X對當歸內在品質的保持具有優(yōu)勢。

    圖4 不同干燥方式當歸薄壁細胞內含淀粉粒Fig.4 Starch granules in parenchyma cells of CA under different drying methods

    圖3 不同干燥方式當歸藥材的油室Fig.3 Oil chamber structure of CA under different drying methods

    3.3 活性物質含量比較

    測定結果表明,4種干燥方式下,P當歸的阿魏酸、歐當歸內酯A和洋川芎內酯A含量均為最高,且與其他干燥方式均有顯著性差異(P<0.05),其中阿魏酸含量分別比X、S和Y高57.4%、36.2%和8.0%;歐當歸內酯A含量分別比X、S和Y高77.8%、14.3%和33.3%;洋川芎內酯A含量分別比X、S和Y高64.9%、96.8%和125.9%。藁本內酯含量在P和Y無顯著性差異,分別比X、S和Y高32.5%、49.5%和11.4%(見表3)。

    表3 不同干燥方式當歸活性成分含量比較

    3.4 抗氧化酶活性比較

    由圖5可知,SOD、CAT、POD酶活性和GSH含量均以S樣品最高(P<0.5),Y和P最低。其中SOD酶活性分別比P、Y、X高78.60%、77.58%、76.70%,CAT酶活性分別比P、Y、X高86.58%、74.88%、78.63%,POD酶活性分別比P、Y、X高82.60%、80.21%、78.15%,GSH含量分別比P、Y、X高73.77%、52.47%、37.07%,而蛋白含量以P和Y樣品的最高,分別為18.31和17.29 mg prot/g,S的含量最低,為3.05 mg prot/g。表明4種干燥方式顯著影響了當歸的抗氧化物酶活性及含量(P<0.05)。預示著干燥過程中發(fā)生了由多種酶催化的復雜生物化學反應,其中酚酸類物質因發(fā)生酶促氧化而導致損失。尤其是當歸在曬干過程中長期暴露于陽光下,藥材體內酶活性增加,加之與空氣充分接觸,加劇了酚酸類物質的大量損失[12],而平衡脫水干燥方式的介質溫度、濕度和干燥時間等條件可控,且處在相對密閉的工況下,能夠抑制多種氧化酶活性,最大限制地保持藥材的內在品質。

    圖5 不同干燥方式對當歸抗氧化酶活性比較Fig.5 Comparison of antioxidant enzymes in CA under different drying methods

    3.5 相關分析

    從表4不同干燥方式下當歸活性成分及抗氧化活性酶相關性分析結果看,總蛋白與洋川芎內酯H和洋川芎內酯I呈極顯著負相關(P<0.01),與洋川芎內酯A、藁本內酯、多糖和揮發(fā)油提取率呈顯著或極顯著正相關(P<0.05或P<0.01);SOD、CAT和POD酶活性均與洋川芎內酯H和洋川芎內酯I呈極顯著正相關(P<0.01),與藁本內酯、多糖含量、揮發(fā)油提取率和總蛋白呈顯著或極顯著負相關(P<0.05或P<0.01);GSH含量與阿魏酸、洋川芎內酯A、藁本內酯、多糖、浸出物和總蛋白呈顯著或極顯著負相關(P<0.05或P<0.01),與洋川芎內酯H和SOD、CAT、POD呈顯著或極顯著正相關(P<0.05或P<0.01)。結果表明,當歸干燥過程是藥材內在品質形成的過程,其生物化學本質是以初生代謝產物(如多糖、總蛋白等)為底物,以多種酶類為催化劑的復雜生物化學過程,其最終產物為次生代謝產物(藁本內酯、阿魏酸、苯肽類等)。

    表4 不同干燥方式下當歸活性物質與抗氧化物酶相關性分析

    3.6 主成分分析

    對11個活性成分進行主成分分析,得到11個成分的初始特征值及貢獻率(表5)。結果顯示:前3個主成分特征值均大于1,說明前3個主成分在當歸質量評價中起著主導作用,3個主成分的累計方差貢獻率達90.965%(>85%),可以代表當歸中11個成分的大部分信息,能夠客觀地反映不同干燥方式當歸藥材的綜合質量的影響。

    表5 旋轉后的主成分特征值及方差貢獻率

    每個主成分包含的各因子其載荷系數綜合反映了所測成分對各主成分的影響[14],由表6可知,洋川芎內酯A和藁本內酯對主成分1有較強的正負荷,洋川芎內酯H對主成分1有較強的逆負荷;歐當歸內酯A對主成分2有明顯的正負荷,阿魏酸松柏酯和揮發(fā)油提取率對主成分2有較強的逆負荷;正丁基苯酞的載荷因子在主成分3中較大,說明干燥方式對當歸藥材的活性成分影響較大。

    表6 旋轉后主成分系數矩陣

    由表6得出各主成分的表達式:

    Y1=0.658Z1-0.750Z2-0.879Z3-0.311Z4+0.876Z5+0.598Z6+0.874Z7+0.249Z8+0.790Z9+0.577Z10+0.774Z11

    Y2=0.597Z1+0.613Z2+0.407Z3-0.690Z4+0.146Z5+0.475Z6+0.086Z7+0.964Z8-0.516Z9-0.717Z10+0.395Z11

    Y3=-0.417Z1-0.005Z2-0.017Z3+0.471Z4+0.445Z5+0.613Z6-0.302Z7-0.032Z8-0.068Z9-0.259Z10+0.161Z11

    以各主要因子的方差貢獻率與3個主成分的總貢獻率之比為權重系數,即各主成分的權重系數為:0.535 1、0.349 0、0.115 9,得到主成分綜合線性組合表達式Y總得分=0.535 1Y1+0.349 0Y2+0.115 9Y3,由表7可知,當歸4種干燥方式下當歸綜合質量平衡脫水干燥>陰干>煙熏>曬干,且該方法干燥耗時較短,生產率較高,該方法可作為道地產區(qū)傳統方法的替代。

    表7 旋轉后主成分因子及綜合評價

    3.7 聚類分析

    采用組間聯接法對當歸不同干燥方法進行聚類分析,結果見圖6,由圖6可知,當臨界值介于5~10時,將當歸干燥方式分為3大類,其中X1(熏干)樣品聚為一類,S1、S2、X3、S3、X2聚為一類,Y1、Y2、Y3、P1、P2、P3樣品聚為一類,說明陰干和平衡脫水干燥的當歸藥材成分含量較為接近。

    圖6 當歸不同干燥方式的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of different drying methods for CA

    4 討論

    中藥材道地性的內涵在藥材表型上體現“優(yōu)形”和“優(yōu)質”,在臨床應用價值上實現“優(yōu)效”[15]。干燥過程在保障中藥材的“優(yōu)形”和“優(yōu)質”和實現“優(yōu)效”中起到最為關鍵的作用。根莖類中藥材為多孔介質物料,其干燥過程一般分為升速、恒速和降速三個階段。物料在干燥過程中,其介質的溫度和含水量不斷發(fā)生變化,屬典型的非穩(wěn)態(tài)不可逆過程[16]。熏干、曬干、陰干等傳統干燥方式難以精準控制階段性變溫和調濕過程,而平衡脫水干燥技術可通過智能化自動控制系統調控階段性變溫和調濕過程,實現藥材內外失水速率保持相對平衡,減少藥材因脫水過快而發(fā)生的過度形變,抑制多種氧化酶活性,避免了苯肽類、揮發(fā)油、酚酸類等物質的氧化分解,最大限度地保持了藥材的內在品質。

    平衡脫水干燥的當歸色澤鮮亮均勻、表面呈黃棕色,皺紋較疏松,油室大小、淀粉粒含量和活性成分含量均顯著高于其它處理,其皮部油樣光澤不明顯,斷面分泌腔呈棕色點狀分布且較多。這與現行中國藥典描述的性狀存有差異。其原因可能與該工藝流程中對所干燥的當歸藥材未采用傳統的搓揉工藝有關,需要在系統升級中加以改進。從中藥資源生態(tài)學的觀點看,中藥材在干燥過程會受到許多非生物脅迫(如高溫、高濕、干旱等)的影響,也會對活性成分組成及藥效物質形成過程中相關的次生代謝途徑、非酶促保護系統形成、抗性蛋白合成、應答基因表達等產生深刻影響。因此今后的研究有必要對中藥材平衡脫水過程中的生理生化及分子機制作深入探究。也要對平衡脫水過程中的水分遷移規(guī)律與機制做進一步深入研究。

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