紫葉李葉黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及最佳采收月份的確定

甄可妙，蘇 琪，閆子涵，國洪賓，高 劍，李夢冉，周程艷*

1河北大學(xué)藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室，保定 071002；2滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，滄州 061000

紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.)，又名紅葉李，薔薇科(Rosaceae)李屬落葉喬木，具有保肝護肝、補中益氣、養(yǎng)陰生津、潤腸通便等功效[1,2]。前期試驗結(jié)果表明其葉中含有大量的黃酮類化合物，為其主要活性成分，主要包含花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚等，其中以花青素含量最多。

黃酮類化合物，又稱生物類黃酮，是一類存在于自然界的、以2-苯基色原酮為母核的化合物，它在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。同時其具有多種顯著的生物活性，可用于治療多種疾病，且具有抗癌防癌作用，在臨床上廣泛應(yīng)用，具有良好的研究價值。蘆丁(rutin)具有多種生理功能，對人體各個器官均有保護作用，如清除自由基、促進成骨細胞的生長、降低血糖、抑制結(jié)腸癌和前列腺癌等[3]。槲皮素(quercetin)是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實中，具有抗氧化、抗病毒、抗炎等作用，在細胞和動物實驗中可以用來治療肝、心、脾、肺、腎、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[4]；花青素(anthocyanin)，又稱花色素，由1個2-苯基苯并吡喃環(huán)和環(huán)上不同的取代基組成，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，通常以糖苷的形式形成花色苷[5]，如花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、花青素3-半乳糖苷、花青素3-蕓香糖苷、花青素丙二酰-鼠李糖苷、花青素戊糖苷、天竺葵色素鼠李糖苷等[6]，紫葉李葉中主要為花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[1]?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、保護肝功能、改善血液循環(huán)、抗癌、抑制炎癥、抗過敏及視力保護等作用，在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景[7]。山奈酚(kaempferol)又稱山奈黃素、山奈素、莰非醇、4′,5,7-三羥黃酮醇、四羥基黃酮，廣泛存在于植物根、葉和果實中，具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效[8,9]。目前對紫葉李葉中黃酮類成分研究較少，尚未有通過測定紫葉李葉中花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚此4種物質(zhì)得率并采用建立權(quán)重公式來計算紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率的報道，采收期亦不明確。

此外，近年來響應(yīng)面法在優(yōu)化黃酮、多糖、多酚等天然有效成分的提取工藝中得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計試驗相比，響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)分析更為詳細，不僅可以直觀看出各因素對得率影響的顯著情況，還可以進一步分析兩因素間存在的交互作用，借助軟件可以三維模擬出更直觀更精準(zhǔn)的最佳提取工藝，預(yù)測值準(zhǔn)確性較高[10]?；诖?，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，運用響應(yīng)面法對紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，并使用最佳工藝處理不同月份紫葉李葉，對紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)進行了分離與測定，計算黃酮類物質(zhì)的權(quán)重得率，最終確定紫葉李葉的最佳采收月份，以期為紫葉李葉的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 材料和試劑

試驗中紫葉李葉于2017年全年按月份在河北大學(xué)本部校園采集，經(jīng)河北大學(xué)周程艷副教授鑒定為薔薇科李屬植物紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.)樹葉，于日光下曬干備用。標(biāo)本(A2201712001)存放于河北大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)研究平臺。甲醇(色譜純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙酸(分析純 天津市泰興試劑廠)；無水乙醇(分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司)。

1.2 儀器和設(shè)備

YL-060S超聲波清洗器(深圳語路有限公司)；LC-UV100 LC-100液相色譜儀(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)；LBR-1型液相色譜柱溫箱(石家莊萊博瑞分析儀器有限公司)；Venusil C18Plus色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司)；TP502型電子天平(上海菁海儀器有限公司)；FA2104N電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil C18Plus(4.6×250 mm，5 μm)；流動相A：1%乙酸，流動相B：100%甲醇，梯度洗脫(0～15 min，75%A；15～16 min，75%A→50%A；16～35 min，50%A；35～36 min，50%A→40%A；36～49 min，40%A；49～50 min，40%A→75%A；50～60 min，75%A)，流速：0.6 mL/min，檢測波長：360 nm，進樣量：20 μL，柱溫：30 ℃[11-13]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g置于燒杯中，加入少量甲醇，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成100 μg/mL的對照品溶液。槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素的對照品溶液均按照此方法配制。將配制好的溶液放入4 ℃冰箱冷藏貯存，待用時用甲醇稀釋至所需濃度梯度，見表1。

表1 對照品溶液的制備

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取同一時間采集的干燥至恒重的紫葉李葉1.00 g，研磨成細粉，置于錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液使料液比達到1∶15，保鮮膜封口，毛細管扎細孔，超聲波清洗器預(yù)熱為50 ℃的條件下將錐形瓶放入并保持此溫度，提取60 min，提取完成后，溶液用濾膜過濾后用甲醇稀釋5倍。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按“2.1”項下色譜條件使用高效液相色譜儀測定“2.2.1”中不同濃度梯度的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)對照品溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對照品溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，繪制4種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

2.3.2 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗，取“2.2”項下供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。精密度試驗，取中濃度的混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。重復(fù)性試驗，按“2.2.2”項中方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。穩(wěn)定性試驗，按“2.2.2”項中方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、3、6、9、12、16、19、21、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。加樣回收率試驗，按“2.2.2”項中方法制備供試品溶液，分別加入折算質(zhì)量為本底量的80%、100%、120%的三種水平的混合對照品溶液，每個濃度平行做三份，進行加樣回收試驗，計算4種黃酮類物質(zhì)在不同添加濃度下的平均回收率與RSD。

2.4 提取液中黃酮類物質(zhì)得率的計算

2.4.1 四種黃酮類物質(zhì)含量測定及得率計算

按“2.2.2”項中方法配制紫葉李葉提取液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定提取液中蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種物質(zhì)的峰面積，通過“2.3.1”項中的回歸方程分別求出提取液中4種物質(zhì)的質(zhì)量濃度，按下式計算各物質(zhì)得率。

W=C×N×V/(M×106)×100%

C：各物質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；N：提取液稀釋倍數(shù)；V：稀釋前提取液體積，mL；M：紫葉李葉質(zhì)量，g

2.4.2 黃酮類物質(zhì)得率計算

根據(jù)蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種黃酮類物質(zhì)的生物活性、研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景分別賦予不同權(quán)重，分別為0.1、0.2、0.3、0.4。根據(jù)上述權(quán)重情況計算黃酮類物質(zhì)的得率，公式為：黃酮類物質(zhì)得率=矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率×0.4+蘆丁得率×0.1+槲皮素得率×0.2+山奈酚得率×0.3。

2.5 單因素試驗

設(shè)計單因素試驗，分別考察液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、提取時間(30、40、50、60、70 min)對黃酮類物質(zhì)得率的影響。液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間四個因素的固定水平分別為15∶1、70%、50 ℃、60 min，在對各因素進行單因素試驗探究時，其他因素均取固定水平。

2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6，運用 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，基于單因素試驗的基礎(chǔ)，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間為考察因素，以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素及水平見表2。

2.7 紫葉李葉最佳采收月份的確定

使用最佳工藝制備不同月份(4～12月份)紫葉李葉提取液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，通過“2.4”項中計算方法計算出不同月份矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的得率及黃酮類物質(zhì)得率。

2.8 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過對4種對照品溶液進行測定，得到的各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程見表3。從計算結(jié)果來看，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 4、0.999 3、1.000 0、0.999 3，說明此4種物質(zhì)分別在0.010～10、0.025～10、0.010～10、0.025～5 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

3.1.2 方法學(xué)考察結(jié)果

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗，色譜圖見圖1，理論塔板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰計不低于5 000，分離度大于1.5，分離良好。精密度試驗，蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.37%、2.26%、2.66%、2.99%，表明儀器的精密度良好；重復(fù)性試驗，蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.56%、2.79%、2.97%、3.13%，表明該方法的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗，蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.26%、2.34%、2.76%、3.01%，表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收率試驗，4種黃酮類物質(zhì)在三種不同添加濃度下的平均回收率在85.66%～108.07%之間，RSD<2%。.

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms注：對照品：(A)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素；(B)蘆??；(C)槲皮素；(D)山奈酚。樣品：(E)紫葉李葉提取液：(a)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素；(b)蘆?。?c)槲皮素；(d)山奈酚。Note:Reference substance:(A) Cyanidin-3-O-glucoside;(B) Rutin;(C) Quercetin;(D) Kaempferol. Sample:(E) Extraction solution of Prunus cerasifera leaves:(a) Cyanidin-3-O-glucoside;(b) Rutin;(c) Quercetin;(d) Kaempferol.

3.2 單因素試驗結(jié)果

乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(A)所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～60%之間時，黃酮類物質(zhì)得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，黃酮類物質(zhì)得率達到最大為0.098%±0.000 3%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時，黃酮類物質(zhì)得率逐漸降低。液料比對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(B)所示，隨著液料比的增加，黃酮類物質(zhì)得率逐漸增加，當(dāng)液料比為20∶1時，黃酮類物質(zhì)得率達到最大為0.127%±0.000 5%。之后隨著液料比的增加，黃酮類物質(zhì)得率降低。提取溫度對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(C)所示，提取溫度在30 ℃～50 ℃時，黃酮類物質(zhì)得率隨溫度的升高而增加，50 ℃時黃酮類物質(zhì)得率最大為0.085%±0.000 3%，之后黃酮類物質(zhì)得率隨溫度升高而降低。提取時間對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(D)所示，隨提取時間的延長，黃酮類物質(zhì)得率先增加后降低。提取時間為50 min時黃酮類物質(zhì)得率達到最大為0.057%±0.000 2%，提取時間超過50 min后黃酮類物質(zhì)得率下降。從上述單因素試驗結(jié)果得出，當(dāng)其他因素固定時，乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比，提取溫度和提取時間分別為60%，20∶1，50 ℃和50 min時，黃酮類物質(zhì)得率最大。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時間對黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.2 Effects of ethanol volume fraction,liquid-material ratio,extraction temperature,extraction time on yield of flavonoids注：圖中小寫字母表示單因素試驗中具有顯著差異的不同處理組(P<0.05)。Note:Lowercase letters mean a significant difference among the different treatments at P<0.05 level in single factor test.

3.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化

3.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間4個因素為變量，以紫葉李葉提取液中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行4因素3水平試驗，結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗的設(shè)計及結(jié)果

采用 Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進行二次多元回歸分析，對自變量A、B、C、D和黃酮類物質(zhì)得率進行多元二項式方程擬合。以紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后得到的回歸方程如下。

Y=0.10+5.757×10-3A-1.546×10-3B-5.027×10-3C+2.131×10-3D+7.022×10-3AB-2.687×10-3AC-7.858×10-3AD-2.322×10-4BC-3.168×10-3BD-2.797×10-3CD-6.866×10-3A2-0.011B2-4.608×10-3C2-3.172×10-3D2。

對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表5?；貧w方程顯著性檢驗P<0.05，表明模型具有顯著性；失擬項P=0.07>0.05，表明方程擬合程度高，無明顯失擬存在，此模型成立。根據(jù)表5中F值的大小可以判斷4個因素對黃酮類物質(zhì)得率的影響程度為：液料比>溫度>時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。一次項A、C，交互項AB、AD，二次項A2對黃酮類物質(zhì)得率的影響顯著(P<0.05)；二次項B2對黃酮類物質(zhì)得率具有極顯著的影響(P<0.01)。

表5 方差分析結(jié)果

黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)面圖見圖3，響應(yīng)面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響程度。響應(yīng)面坡度越陡表示兩因素交互作用越大，反之則表示兩因素交互作用不顯著[14]。可在圖3(C)中看出，液料比和提取時間交互項的響應(yīng)面坡度最陡，說明兩因素交互作用顯著，而其他因素的交互作用不顯著。與表5方差分析結(jié)果一致。

經(jīng)軟件分析，提取紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時間41.62 min，預(yù)測黃酮類物質(zhì)得率為0.105 8%。

3.3.2 驗證試驗

在接下來的工作中為了便于控制試驗條件，將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、液料比25∶1、提取溫度44 ℃、提取時間42 min。應(yīng)用此條件做3次平行試驗，平均黃酮類物質(zhì)得率為0.106 2%±0.000 2%。

圖3 各因素交互作用對紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Responses surface plot showing the interactive effects of different factors on the yield of flavonoids from P. cerasifera leaves

3.4 最佳采收月份的確定

使用軟件分析所得的最佳工藝條件處理不同月份的紫葉李葉，并測定提取液中黃酮類物質(zhì)得率。不同月份紫葉李葉4種黃酮類物質(zhì)得率變化見圖4(A)。在4～12月份，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率呈波浪形變化，在6、8、12月份較高，8～9月份迅速下降；而蘆丁得率總體呈上升趨勢，7～8月份迅速升高，在11月份達到峰值，12月份驟降；槲皮素和山奈酚得率受采摘月份影響均不顯著。加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率變化見圖4(B)，在 4～12月份黃酮類物質(zhì)得率總體呈波浪形變化，12月份最高，8月份得率僅次于12月份。

圖4 不同月份紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率Fig.4 The yield of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months注：(A)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)得率；(B)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)經(jīng)加權(quán)后的得率。Note:(A) The yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months;(B) The weighted yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months.

4 討論與結(jié)論

本試驗對HPLC法中流動相的組成進行了前期考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-1%乙酸為流動相進行測定能夠同時對4種黃酮類物質(zhì)進行很好的分離，且均能達到對稱峰型，無拖尾現(xiàn)象發(fā)生，理論塔板數(shù)較高，亦無其他色譜峰干擾。同時，相關(guān)文獻[11-13]的實驗研究亦表明以甲醇-1%乙酸等為流動相的分離度較好，結(jié)果穩(wěn)定，可信度高。因此，本試驗最終確定以甲醇-1%乙酸為流動相，檢測波長為360 nm。

本試驗采用Box-Behnken分析方法，探討以紫葉李葉為試驗材料，采用超聲波法提取黃酮類物質(zhì)的最佳工藝及其優(yōu)化。在單因素試驗中，采用乙醇溶劑提取，符合黃酮化合物易溶于醇溶劑的特性，同時乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加在一定程度上能夠提高黃酮類物質(zhì)得率，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高會溶解更多雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會與黃酮類物質(zhì)競爭溶劑導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的溶解度降低[15,16]；對液料比而言，液料比的增加在一定程度上能提高黃酮類物質(zhì)得率，當(dāng)液料比增加到一定程度，底物中的其他雜質(zhì)的溶解度也增大，反而會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[15,17]，因此適合的液料比可以有效地溶解黃酮類物質(zhì)，而且不會造成溶劑的浪費；提取溫度方面，適當(dāng)?shù)奶岣邷囟仍谝欢ǔ潭壬夏芴岣唿S酮類物質(zhì)得率，但溫度過高會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)氧化以及其他雜質(zhì)溶解度增加，從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[18,19]；合適的提取時間可以提高黃酮類物質(zhì)得率，過長的提取時間可以使紫葉李葉中雜質(zhì)也相應(yīng)的溶出，從而會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低。在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間為影響因子設(shè)計4因素3水平響應(yīng)曲面試驗，對紫葉李葉黃酮類物質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化，得到的二次回歸模型相關(guān)性顯著(P<0.05)，準(zhǔn)確度、精密度較高，并得出其最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時間41.62 min。同時，還進行了相關(guān)的驗證試驗，結(jié)果與預(yù)測值接近且重復(fù)性好，說明了響應(yīng)面的Box-Behnken 模型優(yōu)化紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)提取工藝的效果良好，該條件具有實際意義，將為其進一步的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的含量會受成熟度、品種、部位、環(huán)境條件、生長季節(jié)等的影響，其中以隨時間變化有規(guī)律可循。紫葉李葉中黃酮類成分主要是花色素，根據(jù)史寶勝[20]的研究了解到紫葉李葉花色素含量的變化主要受光照和溫度的影響，當(dāng)溫度在15 ℃時，相關(guān)酶的活性顯著增強，所以花色素的含量會呈現(xiàn)上升趨勢，但溫度大于35 ℃時，酶活性會受到抑制，花色素的含量會受到影響，甚至?xí)?dǎo)致花色素的分解。光照對花色素含量的影響較大，涉及的原因較多，一般是在春秋兩季節(jié)花色素含量較多，夏季含量較少，因此7月份花色素含量下降是合理的。根據(jù)保定市氣象局記錄[21]，保定市的光照強度也呈現(xiàn)波浪式變化，在2～5月呈上升趨勢，5～7月呈下降趨勢，而溫度在6月的下半個月基本上升到30 ℃以上，7月后溫度繼續(xù)升高，甚至?xí)_到40 ℃的高溫，酶活性嚴(yán)重受到影響。而保定的雨季也基本集中在7、8兩個月，雨季天空云較多，對光照也有影響。8～10月光照時間又是一個先上升后下降的趨勢，溫度在9月以后也基本轉(zhuǎn)涼，因此紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的得率總體呈現(xiàn)波浪形是合理的。

根據(jù)最佳采收月份的試驗結(jié)果和上述的分析表明，12月份黃酮類物質(zhì)得率應(yīng)高于8月份得率，但12月份紫葉李葉生長狀況差，難以大量收集，而8月份紫葉李葉生長旺盛。綜合考慮不同月份紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)得率以及加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率動態(tài)累積變化情況、紫葉李葉的生長狀況，最終確定8月份為最佳采收月份。這樣既能保證矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)得率達到較高水平，又能保證加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率達到高峰。這與其生長發(fā)育及所處的月份有關(guān)，而這種變化的機理有待于進一步的深入研究。

本試驗所采用的方法學(xué)對4種黃酮類物質(zhì)的分離良好，且方法重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，具有較好的準(zhǔn)確性。通過單因素試驗確定了液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間 4 個因素的最佳取值范圍，建立了紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)值與多因素之間的回歸方程模型，確定其最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時間41.62 min。使用最佳提取工藝處理不同月份紫葉李葉，通過權(quán)重公式計算黃酮類物質(zhì)得率，最終確定紫葉李葉最佳采收月份為8月份。該試驗對后期相關(guān)具體成分的提取具有一定的借鑒意義，并對紫葉李的進一步開發(fā)利用具有一定的科學(xué)價值。