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    紫葉李葉黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及最佳采收月份的確定

    2020-08-31 03:45:46甄可妙閆子涵國洪賓李夢冉周程艷

    甄可妙,蘇 琪,閆子涵,國洪賓,高 劍,李夢冉,周程艷*

    1河北大學(xué)藥學(xué)院,河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室,保定 071002;2滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,滄州 061000

    紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.),又名紅葉李,薔薇科(Rosaceae)李屬落葉喬木,具有保肝護肝、補中益氣、養(yǎng)陰生津、潤腸通便等功效[1,2]。前期試驗結(jié)果表明其葉中含有大量的黃酮類化合物,為其主要活性成分,主要包含花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚等,其中以花青素含量最多。

    黃酮類化合物,又稱生物類黃酮,是一類存在于自然界的、以2-苯基色原酮為母核的化合物,它在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。同時其具有多種顯著的生物活性,可用于治療多種疾病,且具有抗癌防癌作用,在臨床上廣泛應(yīng)用,具有良好的研究價值。蘆丁(rutin)具有多種生理功能,對人體各個器官均有保護作用,如清除自由基、促進成骨細胞的生長、降低血糖、抑制結(jié)腸癌和前列腺癌等[3]。槲皮素(quercetin)是一種多羥基黃酮類化合物,廣泛存在于植物的花、葉、果實中,具有抗氧化、抗病毒、抗炎等作用,在細胞和動物實驗中可以用來治療肝、心、脾、肺、腎、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[4];花青素(anthocyanin),又稱花色素,由1個2-苯基苯并吡喃環(huán)和環(huán)上不同的取代基組成,是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,通常以糖苷的形式形成花色苷[5],如花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、花青素3-半乳糖苷、花青素3-蕓香糖苷、花青素丙二酰-鼠李糖苷、花青素戊糖苷、天竺葵色素鼠李糖苷等[6],紫葉李葉中主要為花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[1]?;ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、保護肝功能、改善血液循環(huán)、抗癌、抑制炎癥、抗過敏及視力保護等作用,在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景[7]。山奈酚(kaempferol)又稱山奈黃素、山奈素、莰非醇、4′,5,7-三羥黃酮醇、四羥基黃酮,廣泛存在于植物根、葉和果實中,具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效[8,9]。目前對紫葉李葉中黃酮類成分研究較少,尚未有通過測定紫葉李葉中花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚此4種物質(zhì)得率并采用建立權(quán)重公式來計算紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率的報道,采收期亦不明確。

    此外,近年來響應(yīng)面法在優(yōu)化黃酮、多糖、多酚等天然有效成分的提取工藝中得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計試驗相比,響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)分析更為詳細,不僅可以直觀看出各因素對得率影響的顯著情況,還可以進一步分析兩因素間存在的交互作用,借助軟件可以三維模擬出更直觀更精準(zhǔn)的最佳提取工藝,預(yù)測值準(zhǔn)確性較高[10]?;诖?,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計,運用響應(yīng)面法對紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化,并使用最佳工藝處理不同月份紫葉李葉,對紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)進行了分離與測定,計算黃酮類物質(zhì)的權(quán)重得率,最終確定紫葉李葉的最佳采收月份,以期為紫葉李葉的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 材料和試劑

    試驗中紫葉李葉于2017年全年按月份在河北大學(xué)本部校園采集,經(jīng)河北大學(xué)周程艷副教授鑒定為薔薇科李屬植物紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.)樹葉,于日光下曬干備用。標(biāo)本(A2201712001)存放于河北大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)研究平臺。甲醇(色譜純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙酸(分析純 天津市泰興試劑廠);無水乙醇(分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司);槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司);山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司)。

    1.2 儀器和設(shè)備

    YL-060S超聲波清洗器(深圳語路有限公司);LC-UV100 LC-100液相色譜儀(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司);LBR-1型液相色譜柱溫箱(石家莊萊博瑞分析儀器有限公司);Venusil C18Plus色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司);TP502型電子天平(上海菁海儀器有限公司);FA2104N電子分析天平(上海菁海儀器有限公司);101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

    2 方法

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Venusil C18Plus(4.6×250 mm,5 μm);流動相A:1%乙酸,流動相B:100%甲醇,梯度洗脫(0~15 min,75%A;15~16 min,75%A→50%A;16~35 min,50%A;35~36 min,50%A→40%A;36~49 min,40%A;49~50 min,40%A→75%A;50~60 min,75%A),流速:0.6 mL/min,檢測波長:360 nm,進樣量:20 μL,柱溫:30 ℃[11-13]。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 對照品溶液的制備

    準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g置于燒杯中,加入少量甲醇,超聲溶解,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,制成100 μg/mL的對照品溶液。槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素的對照品溶液均按照此方法配制。將配制好的溶液放入4 ℃冰箱冷藏貯存,待用時用甲醇稀釋至所需濃度梯度,見表1。

    表1 對照品溶液的制備

    2.2.2 供試品溶液的制備

    精密稱取同一時間采集的干燥至恒重的紫葉李葉1.00 g,研磨成細粉,置于錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液使料液比達到1∶15,保鮮膜封口,毛細管扎細孔,超聲波清洗器預(yù)熱為50 ℃的條件下將錐形瓶放入并保持此溫度,提取60 min,提取完成后,溶液用濾膜過濾后用甲醇稀釋5倍。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與方法學(xué)考察

    2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    按“2.1”項下色譜條件使用高效液相色譜儀測定“2.2.1”中不同濃度梯度的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)對照品溶液的峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(y),對照品溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),繪制4種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。

    2.3.2 方法學(xué)考察

    系統(tǒng)適應(yīng)性試驗,取“2.2”項下供試品溶液和對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。精密度試驗,取中濃度的混合對照品溶液適量,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,計算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。重復(fù)性試驗,按“2.2.2”項中方法平行制備供試品溶液6份,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,計算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。穩(wěn)定性試驗,按“2.2.2”項中方法制備供試品溶液,室溫放置,分別于0、3、6、9、12、16、19、21、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定,計算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。加樣回收率試驗,按“2.2.2”項中方法制備供試品溶液,分別加入折算質(zhì)量為本底量的80%、100%、120%的三種水平的混合對照品溶液,每個濃度平行做三份,進行加樣回收試驗,計算4種黃酮類物質(zhì)在不同添加濃度下的平均回收率與RSD。

    2.4 提取液中黃酮類物質(zhì)得率的計算

    2.4.1 四種黃酮類物質(zhì)含量測定及得率計算

    按“2.2.2”項中方法配制紫葉李葉提取液,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測定提取液中蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種物質(zhì)的峰面積,通過“2.3.1”項中的回歸方程分別求出提取液中4種物質(zhì)的質(zhì)量濃度,按下式計算各物質(zhì)得率。

    W=C×N×V/(M×106)×100%

    C:各物質(zhì)質(zhì)量濃度,μg/mL;N:提取液稀釋倍數(shù);V:稀釋前提取液體積,mL;M:紫葉李葉質(zhì)量,g

    2.4.2 黃酮類物質(zhì)得率計算

    根據(jù)蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種黃酮類物質(zhì)的生物活性、研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景分別賦予不同權(quán)重,分別為0.1、0.2、0.3、0.4。根據(jù)上述權(quán)重情況計算黃酮類物質(zhì)的得率,公式為:黃酮類物質(zhì)得率=矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率×0.4+蘆丁得率×0.1+槲皮素得率×0.2+山奈酚得率×0.3。

    2.5 單因素試驗

    設(shè)計單因素試驗,分別考察液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、提取時間(30、40、50、60、70 min)對黃酮類物質(zhì)得率的影響。液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間四個因素的固定水平分別為15∶1、70%、50 ℃、60 min,在對各因素進行單因素試驗探究時,其他因素均取固定水平。

    2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

    采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0.6,運用 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理,基于單因素試驗的基礎(chǔ),以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間為考察因素,以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,進行響應(yīng)面試驗設(shè)計,因素及水平見表2。

    2.7 紫葉李葉最佳采收月份的確定

    使用最佳工藝制備不同月份(4~12月份)紫葉李葉提取液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,通過“2.4”項中計算方法計算出不同月份矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的得率及黃酮類物質(zhì)得率。

    2.8 統(tǒng)計分析

    3 結(jié)果與分析

    3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和方法學(xué)考察結(jié)果

    3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    通過對4種對照品溶液進行測定,得到的各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程見表3。從計算結(jié)果來看,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 4、0.999 3、1.000 0、0.999 3,說明此4種物質(zhì)分別在0.010~10、0.025~10、0.010~10、0.025~5 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

    表3 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

    3.1.2 方法學(xué)考察結(jié)果

    系統(tǒng)適應(yīng)性試驗,色譜圖見圖1,理論塔板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰計不低于5 000,分離度大于1.5,分離良好。精密度試驗,蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.37%、2.26%、2.66%、2.99%,表明儀器的精密度良好;重復(fù)性試驗,蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.56%、2.79%、2.97%、3.13%,表明該方法的重復(fù)性良好;穩(wěn)定性試驗,蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.26%、2.34%、2.76%、3.01%,表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定;加樣回收率試驗,4種黃酮類物質(zhì)在三種不同添加濃度下的平均回收率在85.66%~108.07%之間,RSD<2%。.

    圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms注:對照品:(A)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素;(B)蘆??;(C)槲皮素;(D)山奈酚。樣品:(E)紫葉李葉提取液:(a)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素;(b)蘆?。?c)槲皮素;(d)山奈酚。Note:Reference substance:(A) Cyanidin-3-O-glucoside;(B) Rutin;(C) Quercetin;(D) Kaempferol. Sample:(E) Extraction solution of Prunus cerasifera leaves:(a) Cyanidin-3-O-glucoside;(b) Rutin;(c) Quercetin;(d) Kaempferol.

    3.2 單因素試驗結(jié)果

    乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(A)所示,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%~60%之間時,黃酮類物質(zhì)得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時,黃酮類物質(zhì)得率達到最大為0.098%±0.000 3%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時,黃酮類物質(zhì)得率逐漸降低。液料比對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(B)所示,隨著液料比的增加,黃酮類物質(zhì)得率逐漸增加,當(dāng)液料比為20∶1時,黃酮類物質(zhì)得率達到最大為0.127%±0.000 5%。之后隨著液料比的增加,黃酮類物質(zhì)得率降低。提取溫度對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(C)所示,提取溫度在30 ℃~50 ℃時,黃酮類物質(zhì)得率隨溫度的升高而增加,50 ℃時黃酮類物質(zhì)得率最大為0.085%±0.000 3%,之后黃酮類物質(zhì)得率隨溫度升高而降低。提取時間對黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(D)所示,隨提取時間的延長,黃酮類物質(zhì)得率先增加后降低。提取時間為50 min時黃酮類物質(zhì)得率達到最大為0.057%±0.000 2%,提取時間超過50 min后黃酮類物質(zhì)得率下降。從上述單因素試驗結(jié)果得出,當(dāng)其他因素固定時,乙醇體積分?jǐn)?shù),液料比,提取溫度和提取時間分別為60%,20∶1,50 ℃和50 min時,黃酮類物質(zhì)得率最大。

    圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時間對黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.2 Effects of ethanol volume fraction,liquid-material ratio,extraction temperature,extraction time on yield of flavonoids注:圖中小寫字母表示單因素試驗中具有顯著差異的不同處理組(P<0.05)。Note:Lowercase letters mean a significant difference among the different treatments at P<0.05 level in single factor test.

    3.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化

    3.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間4個因素為變量,以紫葉李葉提取液中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行4因素3水平試驗,結(jié)果見表4。

    表4 Box-Behnken試驗的設(shè)計及結(jié)果

    采用 Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進行二次多元回歸分析,對自變量A、B、C、D和黃酮類物質(zhì)得率進行多元二項式方程擬合。以紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后得到的回歸方程如下。

    Y=0.10+5.757×10-3A-1.546×10-3B-5.027×10-3C+2.131×10-3D+7.022×10-3AB-2.687×10-3AC-7.858×10-3AD-2.322×10-4BC-3.168×10-3BD-2.797×10-3CD-6.866×10-3A2-0.011B2-4.608×10-3C2-3.172×10-3D2。

    對回歸方程進行方差分析,結(jié)果見表5?;貧w方程顯著性檢驗P<0.05,表明模型具有顯著性;失擬項P=0.07>0.05,表明方程擬合程度高,無明顯失擬存在,此模型成立。根據(jù)表5中F值的大小可以判斷4個因素對黃酮類物質(zhì)得率的影響程度為:液料比>溫度>時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。一次項A、C,交互項AB、AD,二次項A2對黃酮類物質(zhì)得率的影響顯著(P<0.05);二次項B2對黃酮類物質(zhì)得率具有極顯著的影響(P<0.01)。

    表5 方差分析結(jié)果

    黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)面圖見圖3,響應(yīng)面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響程度。響應(yīng)面坡度越陡表示兩因素交互作用越大,反之則表示兩因素交互作用不顯著[14]。可在圖3(C)中看出,液料比和提取時間交互項的響應(yīng)面坡度最陡,說明兩因素交互作用顯著,而其他因素的交互作用不顯著。與表5方差分析結(jié)果一致。

    經(jīng)軟件分析,提取紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時間41.62 min,預(yù)測黃酮類物質(zhì)得率為0.105 8%。

    3.3.2 驗證試驗

    在接下來的工作中為了便于控制試驗條件,將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、液料比25∶1、提取溫度44 ℃、提取時間42 min。應(yīng)用此條件做3次平行試驗,平均黃酮類物質(zhì)得率為0.106 2%±0.000 2%。

    圖3 各因素交互作用對紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Responses surface plot showing the interactive effects of different factors on the yield of flavonoids from P. cerasifera leaves

    3.4 最佳采收月份的確定

    使用軟件分析所得的最佳工藝條件處理不同月份的紫葉李葉,并測定提取液中黃酮類物質(zhì)得率。不同月份紫葉李葉4種黃酮類物質(zhì)得率變化見圖4(A)。在4~12月份,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率呈波浪形變化,在6、8、12月份較高,8~9月份迅速下降;而蘆丁得率總體呈上升趨勢,7~8月份迅速升高,在11月份達到峰值,12月份驟降;槲皮素和山奈酚得率受采摘月份影響均不顯著。加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率變化見圖4(B),在 4~12月份黃酮類物質(zhì)得率總體呈波浪形變化,12月份最高,8月份得率僅次于12月份。

    圖4 不同月份紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率Fig.4 The yield of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months注:(A)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)得率;(B)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)經(jīng)加權(quán)后的得率。Note:(A) The yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months;(B) The weighted yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months.

    4 討論與結(jié)論

    本試驗對HPLC法中流動相的組成進行了前期考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用甲醇-1%乙酸為流動相進行測定能夠同時對4種黃酮類物質(zhì)進行很好的分離,且均能達到對稱峰型,無拖尾現(xiàn)象發(fā)生,理論塔板數(shù)較高,亦無其他色譜峰干擾。同時,相關(guān)文獻[11-13]的實驗研究亦表明以甲醇-1%乙酸等為流動相的分離度較好,結(jié)果穩(wěn)定,可信度高。因此,本試驗最終確定以甲醇-1%乙酸為流動相,檢測波長為360 nm。

    本試驗采用Box-Behnken分析方法,探討以紫葉李葉為試驗材料,采用超聲波法提取黃酮類物質(zhì)的最佳工藝及其優(yōu)化。在單因素試驗中,采用乙醇溶劑提取,符合黃酮化合物易溶于醇溶劑的特性,同時乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加在一定程度上能夠提高黃酮類物質(zhì)得率,但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高會溶解更多雜質(zhì),這些雜質(zhì)會與黃酮類物質(zhì)競爭溶劑導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的溶解度降低[15,16];對液料比而言,液料比的增加在一定程度上能提高黃酮類物質(zhì)得率,當(dāng)液料比增加到一定程度,底物中的其他雜質(zhì)的溶解度也增大,反而會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[15,17],因此適合的液料比可以有效地溶解黃酮類物質(zhì),而且不會造成溶劑的浪費;提取溫度方面,適當(dāng)?shù)奶岣邷囟仍谝欢ǔ潭壬夏芴岣唿S酮類物質(zhì)得率,但溫度過高會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)氧化以及其他雜質(zhì)溶解度增加,從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[18,19];合適的提取時間可以提高黃酮類物質(zhì)得率,過長的提取時間可以使紫葉李葉中雜質(zhì)也相應(yīng)的溶出,從而會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低。在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上,按照Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理,以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間為影響因子設(shè)計4因素3水平響應(yīng)曲面試驗,對紫葉李葉黃酮類物質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化,得到的二次回歸模型相關(guān)性顯著(P<0.05),準(zhǔn)確度、精密度較高,并得出其最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時間41.62 min。同時,還進行了相關(guān)的驗證試驗,結(jié)果與預(yù)測值接近且重復(fù)性好,說明了響應(yīng)面的Box-Behnken 模型優(yōu)化紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)提取工藝的效果良好,該條件具有實際意義,將為其進一步的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

    紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的含量會受成熟度、品種、部位、環(huán)境條件、生長季節(jié)等的影響,其中以隨時間變化有規(guī)律可循。紫葉李葉中黃酮類成分主要是花色素,根據(jù)史寶勝[20]的研究了解到紫葉李葉花色素含量的變化主要受光照和溫度的影響,當(dāng)溫度在15 ℃時,相關(guān)酶的活性顯著增強,所以花色素的含量會呈現(xiàn)上升趨勢,但溫度大于35 ℃時,酶活性會受到抑制,花色素的含量會受到影響,甚至?xí)?dǎo)致花色素的分解。光照對花色素含量的影響較大,涉及的原因較多,一般是在春秋兩季節(jié)花色素含量較多,夏季含量較少,因此7月份花色素含量下降是合理的。根據(jù)保定市氣象局記錄[21],保定市的光照強度也呈現(xiàn)波浪式變化,在2~5月呈上升趨勢,5~7月呈下降趨勢,而溫度在6月的下半個月基本上升到30 ℃以上,7月后溫度繼續(xù)升高,甚至?xí)_到40 ℃的高溫,酶活性嚴(yán)重受到影響。而保定的雨季也基本集中在7、8兩個月,雨季天空云較多,對光照也有影響。8~10月光照時間又是一個先上升后下降的趨勢,溫度在9月以后也基本轉(zhuǎn)涼,因此紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的得率總體呈現(xiàn)波浪形是合理的。

    根據(jù)最佳采收月份的試驗結(jié)果和上述的分析表明,12月份黃酮類物質(zhì)得率應(yīng)高于8月份得率,但12月份紫葉李葉生長狀況差,難以大量收集,而8月份紫葉李葉生長旺盛。綜合考慮不同月份紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)得率以及加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率動態(tài)累積變化情況、紫葉李葉的生長狀況,最終確定8月份為最佳采收月份。這樣既能保證矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)得率達到較高水平,又能保證加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率達到高峰。這與其生長發(fā)育及所處的月份有關(guān),而這種變化的機理有待于進一步的深入研究。

    本試驗所采用的方法學(xué)對4種黃酮類物質(zhì)的分離良好,且方法重復(fù)性高,穩(wěn)定性好,具有較好的準(zhǔn)確性。通過單因素試驗確定了液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間 4 個因素的最佳取值范圍,建立了紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)值與多因素之間的回歸方程模型,確定其最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時間41.62 min。使用最佳提取工藝處理不同月份紫葉李葉,通過權(quán)重公式計算黃酮類物質(zhì)得率,最終確定紫葉李葉最佳采收月份為8月份。該試驗對后期相關(guān)具體成分的提取具有一定的借鑒意義,并對紫葉李的進一步開發(fā)利用具有一定的科學(xué)價值。

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