甄可妙,蘇 琪,閆子涵,國(guó)洪賓,高 劍,李夢(mèng)冉,周程艷*
1河北大學(xué)藥學(xué)院,河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,保定 071002;2滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,滄州 061000
紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.),又名紅葉李,薔薇科(Rosaceae)李屬落葉喬木,具有保肝護(hù)肝、補(bǔ)中益氣、養(yǎng)陰生津、潤(rùn)腸通便等功效[1,2]。前期試驗(yàn)結(jié)果表明其葉中含有大量的黃酮類化合物,為其主要活性成分,主要包含花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚等,其中以花青素含量最多。
黃酮類化合物,又稱生物類黃酮,是一類存在于自然界的、以2-苯基色原酮為母核的化合物,它在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。同時(shí)其具有多種顯著的生物活性,可用于治療多種疾病,且具有抗癌防癌作用,在臨床上廣泛應(yīng)用,具有良好的研究?jī)r(jià)值。蘆丁(rutin)具有多種生理功能,對(duì)人體各個(gè)器官均有保護(hù)作用,如清除自由基、促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低血糖、抑制結(jié)腸癌和前列腺癌等[3]。槲皮素(quercetin)是一種多羥基黃酮類化合物,廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中,具有抗氧化、抗病毒、抗炎等作用,在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以用來(lái)治療肝、心、脾、肺、腎、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[4];花青素(anthocyanin),又稱花色素,由1個(gè)2-苯基苯并吡喃環(huán)和環(huán)上不同的取代基組成,是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,通常以糖苷的形式形成花色苷[5],如花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、花青素3-半乳糖苷、花青素3-蕓香糖苷、花青素丙二酰-鼠李糖苷、花青素戊糖苷、天竺葵色素鼠李糖苷等[6],紫葉李葉中主要為花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[1]?;ㄇ嗨鼐哂锌寡趸⒈Wo(hù)肝功能、改善血液循環(huán)、抗癌、抑制炎癥、抗過(guò)敏及視力保護(hù)等作用,在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景[7]。山奈酚(kaempferol)又稱山奈黃素、山奈素、莰非醇、4′,5,7-三羥黃酮醇、四羥基黃酮,廣泛存在于植物根、葉和果實(shí)中,具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效[8,9]。目前對(duì)紫葉李葉中黃酮類成分研究較少,尚未有通過(guò)測(cè)定紫葉李葉中花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚此4種物質(zhì)得率并采用建立權(quán)重公式來(lái)計(jì)算紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率的報(bào)道,采收期亦不明確。
此外,近年來(lái)響應(yīng)面法在優(yōu)化黃酮、多糖、多酚等天然有效成分的提取工藝中得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相比,響應(yīng)面法對(duì)數(shù)據(jù)分析更為詳細(xì),不僅可以直觀看出各因素對(duì)得率影響的顯著情況,還可以進(jìn)一步分析兩因素間存在的交互作用,借助軟件可以三維模擬出更直觀更精準(zhǔn)的最佳提取工藝,預(yù)測(cè)值準(zhǔn)確性較高[10]?;诖?,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計(jì),運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并使用最佳工藝處理不同月份紫葉李葉,對(duì)紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了分離與測(cè)定,計(jì)算黃酮類物質(zhì)的權(quán)重得率,最終確定紫葉李葉的最佳采收月份,以期為紫葉李葉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
試驗(yàn)中紫葉李葉于2017年全年按月份在河北大學(xué)本部校園采集,經(jīng)河北大學(xué)周程艷副教授鑒定為薔薇科李屬植物紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.)樹(shù)葉,于日光下曬干備用。標(biāo)本(A2201712001)存放于河北大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)研究平臺(tái)。甲醇(色譜純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙酸(分析純 天津市泰興試劑廠);無(wú)水乙醇(分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司);槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司);山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司)。
YL-060S超聲波清洗器(深圳語(yǔ)路有限公司);LC-UV100 LC-100液相色譜儀(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司);LBR-1型液相色譜柱溫箱(石家莊萊博瑞分析儀器有限公司);Venusil C18Plus色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司);TP502型電子天平(上海菁海儀器有限公司);FA2104N電子分析天平(上海菁海儀器有限公司);101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。
色譜柱:Venusil C18Plus(4.6×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A:1%乙酸,流動(dòng)相B:100%甲醇,梯度洗脫(0~15 min,75%A;15~16 min,75%A→50%A;16~35 min,50%A;35~36 min,50%A→40%A;36~49 min,40%A;49~50 min,40%A→75%A;50~60 min,75%A),流速:0.6 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm,進(jìn)樣量:20 μL,柱溫:30 ℃[11-13]。
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備
準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g置于燒杯中,加入少量甲醇,超聲溶解,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,制成100 μg/mL的對(duì)照品溶液。槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素的對(duì)照品溶液均按照此方法配制。將配制好的溶液放入4 ℃冰箱冷藏貯存,待用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度梯度,見(jiàn)表1。
表1 對(duì)照品溶液的制備
2.2.2 供試品溶液的制備
精密稱取同一時(shí)間采集的干燥至恒重的紫葉李葉1.00 g,研磨成細(xì)粉,置于錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液使料液比達(dá)到1∶15,保鮮膜封口,毛細(xì)管扎細(xì)孔,超聲波清洗器預(yù)熱為50 ℃的條件下將錐形瓶放入并保持此溫度,提取60 min,提取完成后,溶液用濾膜過(guò)濾后用甲醇稀釋5倍。
2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
按“2.1”項(xiàng)下色譜條件使用高效液相色譜儀測(cè)定“2.2.1”中不同濃度梯度的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)對(duì)照品溶液的峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(y),對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),繪制4種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。
2.3.2 方法學(xué)考察
系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn),取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。精密度試驗(yàn),取中濃度的混合對(duì)照品溶液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。重復(fù)性試驗(yàn),按“2.2.2”項(xiàng)中方法平行制備供試品溶液6份,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。穩(wěn)定性試驗(yàn),按“2.2.2”項(xiàng)中方法制備供試品溶液,室溫放置,分別于0、3、6、9、12、16、19、21、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。加樣回收率試驗(yàn),按“2.2.2”項(xiàng)中方法制備供試品溶液,分別加入折算質(zhì)量為本底量的80%、100%、120%的三種水平的混合對(duì)照品溶液,每個(gè)濃度平行做三份,進(jìn)行加樣回收試驗(yàn),計(jì)算4種黃酮類物質(zhì)在不同添加濃度下的平均回收率與RSD。
2.4.1 四種黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定及得率計(jì)算
按“2.2.2”項(xiàng)中方法配制紫葉李葉提取液,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定提取液中蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種物質(zhì)的峰面積,通過(guò)“2.3.1”項(xiàng)中的回歸方程分別求出提取液中4種物質(zhì)的質(zhì)量濃度,按下式計(jì)算各物質(zhì)得率。
W=C×N×V/(M×106)×100%
C:各物質(zhì)質(zhì)量濃度,μg/mL;N:提取液稀釋倍數(shù);V:稀釋前提取液體積,mL;M:紫葉李葉質(zhì)量,g
2.4.2 黃酮類物質(zhì)得率計(jì)算
根據(jù)蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種黃酮類物質(zhì)的生物活性、研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景分別賦予不同權(quán)重,分別為0.1、0.2、0.3、0.4。根據(jù)上述權(quán)重情況計(jì)算黃酮類物質(zhì)的得率,公式為:黃酮類物質(zhì)得率=矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率×0.4+蘆丁得率×0.1+槲皮素得率×0.2+山奈酚得率×0.3。
設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn),分別考察液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、提取時(shí)間(30、40、50、60、70 min)對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響。液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素的固定水平分別為15∶1、70%、50 ℃、60 min,在對(duì)各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)探究時(shí),其他因素均取固定水平。
采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6,運(yùn)用 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,基于單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ),以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素,以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素及水平見(jiàn)表2。
使用最佳工藝制備不同月份(4~12月份)紫葉李葉提取液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,通過(guò)“2.4”項(xiàng)中計(jì)算方法計(jì)算出不同月份矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的得率及黃酮類物質(zhì)得率。
3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
通過(guò)對(duì)4種對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定,得到的各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程見(jiàn)表3。從計(jì)算結(jié)果來(lái)看,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 4、0.999 3、1.000 0、0.999 3,說(shuō)明此4種物質(zhì)分別在0.010~10、0.025~10、0.010~10、0.025~5 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
表3 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)
3.1.2 方法學(xué)考察結(jié)果
系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn),色譜圖見(jiàn)圖1,理論塔板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰計(jì)不低于5 000,分離度大于1.5,分離良好。精密度試驗(yàn),蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.37%、2.26%、2.66%、2.99%,表明儀器的精密度良好;重復(fù)性試驗(yàn),蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.56%、2.79%、2.97%、3.13%,表明該方法的重復(fù)性良好;穩(wěn)定性試驗(yàn),蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.26%、2.34%、2.76%、3.01%,表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定;加樣回收率試驗(yàn),4種黃酮類物質(zhì)在三種不同添加濃度下的平均回收率在85.66%~108.07%之間,RSD<2%。.
圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms注:對(duì)照品:(A)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素;(B)蘆??;(C)槲皮素;(D)山奈酚。樣品:(E)紫葉李葉提取液:(a)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素;(b)蘆丁;(c)槲皮素;(d)山奈酚。Note:Reference substance:(A) Cyanidin-3-O-glucoside;(B) Rutin;(C) Quercetin;(D) Kaempferol. Sample:(E) Extraction solution of Prunus cerasifera leaves:(a) Cyanidin-3-O-glucoside;(b) Rutin;(c) Quercetin;(d) Kaempferol.
乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(A)所示,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%~60%之間時(shí),黃酮類物質(zhì)得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大為0.098%±0.000 3%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí),黃酮類物質(zhì)得率逐漸降低。液料比對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(B)所示,隨著液料比的增加,黃酮類物質(zhì)得率逐漸增加,當(dāng)液料比為20∶1時(shí),黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大為0.127%±0.000 5%。之后隨著液料比的增加,黃酮類物質(zhì)得率降低。提取溫度對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(C)所示,提取溫度在30 ℃~50 ℃時(shí),黃酮類物質(zhì)得率隨溫度的升高而增加,50 ℃時(shí)黃酮類物質(zhì)得率最大為0.085%±0.000 3%,之后黃酮類物質(zhì)得率隨溫度升高而降低。提取時(shí)間對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(D)所示,隨提取時(shí)間的延長(zhǎng),黃酮類物質(zhì)得率先增加后降低。提取時(shí)間為50 min時(shí)黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大為0.057%±0.000 2%,提取時(shí)間超過(guò)50 min后黃酮類物質(zhì)得率下降。從上述單因素試驗(yàn)結(jié)果得出,當(dāng)其他因素固定時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù),液料比,提取溫度和提取時(shí)間分別為60%,20∶1,50 ℃和50 min時(shí),黃酮類物質(zhì)得率最大。
圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.2 Effects of ethanol volume fraction,liquid-material ratio,extraction temperature,extraction time on yield of flavonoids注:圖中小寫字母表示單因素試驗(yàn)中具有顯著差異的不同處理組(P<0.05)。Note:Lowercase letters mean a significant difference among the different treatments at P<0.05 level in single factor test.
3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素為變量,以紫葉李葉提取液中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果
采用 Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸分析,對(duì)自變量A、B、C、D和黃酮類物質(zhì)得率進(jìn)行多元二項(xiàng)式方程擬合。以紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后得到的回歸方程如下。
Y=0.10+5.757×10-3A-1.546×10-3B-5.027×10-3C+2.131×10-3D+7.022×10-3AB-2.687×10-3AC-7.858×10-3AD-2.322×10-4BC-3.168×10-3BD-2.797×10-3CD-6.866×10-3A2-0.011B2-4.608×10-3C2-3.172×10-3D2。
對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表5。回歸方程顯著性檢驗(yàn)P<0.05,表明模型具有顯著性;失擬項(xiàng)P=0.07>0.05,表明方程擬合程度高,無(wú)明顯失擬存在,此模型成立。根據(jù)表5中F值的大小可以判斷4個(gè)因素對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響程度為:液料比>溫度>時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。一次項(xiàng)A、C,交互項(xiàng)AB、AD,二次項(xiàng)A2對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響顯著(P<0.05);二次項(xiàng)B2對(duì)黃酮類物質(zhì)得率具有極顯著的影響(P<0.01)。
表5 方差分析結(jié)果
黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3,響應(yīng)面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度。響應(yīng)面坡度越陡表示兩因素交互作用越大,反之則表示兩因素交互作用不顯著[14]??稍趫D3(C)中看出,液料比和提取時(shí)間交互項(xiàng)的響應(yīng)面坡度最陡,說(shuō)明兩因素交互作用顯著,而其他因素的交互作用不顯著。與表5方差分析結(jié)果一致。
經(jīng)軟件分析,提取紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時(shí)間41.62 min,預(yù)測(cè)黃酮類物質(zhì)得率為0.105 8%。
3.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)
在接下來(lái)的工作中為了便于控制試驗(yàn)條件,將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、液料比25∶1、提取溫度44 ℃、提取時(shí)間42 min。應(yīng)用此條件做3次平行試驗(yàn),平均黃酮類物質(zhì)得率為0.106 2%±0.000 2%。
圖3 各因素交互作用對(duì)紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Responses surface plot showing the interactive effects of different factors on the yield of flavonoids from P. cerasifera leaves
使用軟件分析所得的最佳工藝條件處理不同月份的紫葉李葉,并測(cè)定提取液中黃酮類物質(zhì)得率。不同月份紫葉李葉4種黃酮類物質(zhì)得率變化見(jiàn)圖4(A)。在4~12月份,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率呈波浪形變化,在6、8、12月份較高,8~9月份迅速下降;而蘆丁得率總體呈上升趨勢(shì),7~8月份迅速升高,在11月份達(dá)到峰值,12月份驟降;槲皮素和山奈酚得率受采摘月份影響均不顯著。加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率變化見(jiàn)圖4(B),在 4~12月份黃酮類物質(zhì)得率總體呈波浪形變化,12月份最高,8月份得率僅次于12月份。
圖4 不同月份紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率Fig.4 The yield of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months注:(A)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)得率;(B)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)經(jīng)加權(quán)后的得率。Note:(A) The yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months;(B) The weighted yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months.
本試驗(yàn)對(duì)HPLC法中流動(dòng)相的組成進(jìn)行了前期考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用甲醇-1%乙酸為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定能夠同時(shí)對(duì)4種黃酮類物質(zhì)進(jìn)行很好的分離,且均能達(dá)到對(duì)稱峰型,無(wú)拖尾現(xiàn)象發(fā)生,理論塔板數(shù)較高,亦無(wú)其他色譜峰干擾。同時(shí),相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]的實(shí)驗(yàn)研究亦表明以甲醇-1%乙酸等為流動(dòng)相的分離度較好,結(jié)果穩(wěn)定,可信度高。因此,本試驗(yàn)最終確定以甲醇-1%乙酸為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。
本試驗(yàn)采用Box-Behnken分析方法,探討以紫葉李葉為試驗(yàn)材料,采用超聲波法提取黃酮類物質(zhì)的最佳工藝及其優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)中,采用乙醇溶劑提取,符合黃酮化合物易溶于醇溶劑的特性,同時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加在一定程度上能夠提高黃酮類物質(zhì)得率,但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)溶解更多雜質(zhì),這些雜質(zhì)會(huì)與黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶劑導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的溶解度降低[15,16];對(duì)液料比而言,液料比的增加在一定程度上能提高黃酮類物質(zhì)得率,當(dāng)液料比增加到一定程度,底物中的其他雜質(zhì)的溶解度也增大,反而會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[15,17],因此適合的液料比可以有效地溶解黃酮類物質(zhì),而且不會(huì)造成溶劑的浪費(fèi);提取溫度方面,適當(dāng)?shù)奶岣邷囟仍谝欢ǔ潭壬夏芴岣唿S酮類物質(zhì)得率,但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)氧化以及其他雜質(zhì)溶解度增加,從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[18,19];合適的提取時(shí)間可以提高黃酮類物質(zhì)得率,過(guò)長(zhǎng)的提取時(shí)間可以使紫葉李葉中雜質(zhì)也相應(yīng)的溶出,從而會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低。在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按照Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值,以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間為影響因子設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)曲面試驗(yàn),對(duì)紫葉李葉黃酮類物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到的二次回歸模型相關(guān)性顯著(P<0.05),準(zhǔn)確度、精密度較高,并得出其最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時(shí)間41.62 min。同時(shí),還進(jìn)行了相關(guān)的驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近且重復(fù)性好,說(shuō)明了響應(yīng)面的Box-Behnken 模型優(yōu)化紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)提取工藝的效果良好,該條件具有實(shí)際意義,將為其進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的含量會(huì)受成熟度、品種、部位、環(huán)境條件、生長(zhǎng)季節(jié)等的影響,其中以隨時(shí)間變化有規(guī)律可循。紫葉李葉中黃酮類成分主要是花色素,根據(jù)史寶勝[20]的研究了解到紫葉李葉花色素含量的變化主要受光照和溫度的影響,當(dāng)溫度在15 ℃時(shí),相關(guān)酶的活性顯著增強(qiáng),所以花色素的含量會(huì)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),但溫度大于35 ℃時(shí),酶活性會(huì)受到抑制,花色素的含量會(huì)受到影響,甚至?xí)?dǎo)致花色素的分解。光照對(duì)花色素含量的影響較大,涉及的原因較多,一般是在春秋兩季節(jié)花色素含量較多,夏季含量較少,因此7月份花色素含量下降是合理的。根據(jù)保定市氣象局記錄[21],保定市的光照強(qiáng)度也呈現(xiàn)波浪式變化,在2~5月呈上升趨勢(shì),5~7月呈下降趨勢(shì),而溫度在6月的下半個(gè)月基本上升到30 ℃以上,7月后溫度繼續(xù)升高,甚至?xí)_(dá)到40 ℃的高溫,酶活性嚴(yán)重受到影響。而保定的雨季也基本集中在7、8兩個(gè)月,雨季天空云較多,對(duì)光照也有影響。8~10月光照時(shí)間又是一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì),溫度在9月以后也基本轉(zhuǎn)涼,因此紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的得率總體呈現(xiàn)波浪形是合理的。
根據(jù)最佳采收月份的試驗(yàn)結(jié)果和上述的分析表明,12月份黃酮類物質(zhì)得率應(yīng)高于8月份得率,但12月份紫葉李葉生長(zhǎng)狀況差,難以大量收集,而8月份紫葉李葉生長(zhǎng)旺盛。綜合考慮不同月份紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)得率以及加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率動(dòng)態(tài)累積變化情況、紫葉李葉的生長(zhǎng)狀況,最終確定8月份為最佳采收月份。這樣既能保證矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)得率達(dá)到較高水平,又能保證加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到高峰。這與其生長(zhǎng)發(fā)育及所處的月份有關(guān),而這種變化的機(jī)理有待于進(jìn)一步的深入研究。
本試驗(yàn)所采用的方法學(xué)對(duì)4種黃酮類物質(zhì)的分離良好,且方法重復(fù)性高,穩(wěn)定性好,具有較好的準(zhǔn)確性。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間 4 個(gè)因素的最佳取值范圍,建立了紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)值與多因素之間的回歸方程模型,確定其最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時(shí)間41.62 min。使用最佳提取工藝處理不同月份紫葉李葉,通過(guò)權(quán)重公式計(jì)算黃酮類物質(zhì)得率,最終確定紫葉李葉最佳采收月份為8月份。該試驗(yàn)對(duì)后期相關(guān)具體成分的提取具有一定的借鑒意義,并對(duì)紫葉李的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有一定的科學(xué)價(jià)值。