紫葉李葉黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及最佳采收月份的確定

甄可妙，蘇 琪，閆子涵，國(guó)洪賓，高 劍，李夢(mèng)冉，周程艷*

1河北大學(xué)藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071002；2滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，滄州 061000

紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.)，又名紅葉李，薔薇科(Rosaceae)李屬落葉喬木，具有保肝護(hù)肝、補(bǔ)中益氣、養(yǎng)陰生津、潤(rùn)腸通便等功效[1,2]。前期試驗(yàn)結(jié)果表明其葉中含有大量的黃酮類化合物，為其主要活性成分，主要包含花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚等，其中以花青素含量最多。

黃酮類化合物，又稱生物類黃酮，是一類存在于自然界的、以2-苯基色原酮為母核的化合物，它在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。同時(shí)其具有多種顯著的生物活性，可用于治療多種疾病，且具有抗癌防癌作用，在臨床上廣泛應(yīng)用，具有良好的研究?jī)r(jià)值。蘆丁(rutin)具有多種生理功能，對(duì)人體各個(gè)器官均有保護(hù)作用，如清除自由基、促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低血糖、抑制結(jié)腸癌和前列腺癌等[3]。槲皮素(quercetin)是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中，具有抗氧化、抗病毒、抗炎等作用，在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以用來(lái)治療肝、心、脾、肺、腎、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[4]；花青素(anthocyanin)，又稱花色素，由1個(gè)2-苯基苯并吡喃環(huán)和環(huán)上不同的取代基組成，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，通常以糖苷的形式形成花色苷[5]，如花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、花青素3-半乳糖苷、花青素3-蕓香糖苷、花青素丙二酰-鼠李糖苷、花青素戊糖苷、天竺葵色素鼠李糖苷等[6]，紫葉李葉中主要為花青素矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[1]?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸⒈Ｗo(hù)肝功能、改善血液循環(huán)、抗癌、抑制炎癥、抗過(guò)敏及視力保護(hù)等作用，在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景[7]。山奈酚(kaempferol)又稱山奈黃素、山奈素、莰非醇、4′,5,7-三羥黃酮醇、四羥基黃酮，廣泛存在于植物根、葉和果實(shí)中，具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效[8,9]。目前對(duì)紫葉李葉中黃酮類成分研究較少，尚未有通過(guò)測(cè)定紫葉李葉中花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚此4種物質(zhì)得率并采用建立權(quán)重公式來(lái)計(jì)算紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率的報(bào)道，采收期亦不明確。

此外，近年來(lái)響應(yīng)面法在優(yōu)化黃酮、多糖、多酚等天然有效成分的提取工藝中得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相比，響應(yīng)面法對(duì)數(shù)據(jù)分析更為詳細(xì)，不僅可以直觀看出各因素對(duì)得率影響的顯著情況，還可以進(jìn)一步分析兩因素間存在的交互作用，借助軟件可以三維模擬出更直觀更精準(zhǔn)的最佳提取工藝，預(yù)測(cè)值準(zhǔn)確性較高[10]?；诖?，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并使用最佳工藝處理不同月份紫葉李葉，對(duì)紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了分離與測(cè)定，計(jì)算黃酮類物質(zhì)的權(quán)重得率，最終確定紫葉李葉的最佳采收月份，以期為紫葉李葉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)中紫葉李葉于2017年全年按月份在河北大學(xué)本部校園采集，經(jīng)河北大學(xué)周程艷副教授鑒定為薔薇科李屬植物紫葉李(PrunuscerasiferaEhrh. cv.atropurpureaJacg.)樹(shù)葉，于日光下曬干備用。標(biāo)本(A2201712001)存放于河北大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)研究平臺(tái)。甲醇(色譜純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙酸(分析純 天津市泰興試劑廠)；無(wú)水乙醇(分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)；山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司)。

1.2 儀器和設(shè)備

YL-060S超聲波清洗器(深圳語(yǔ)路有限公司)；LC-UV100 LC-100液相色譜儀(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)；LBR-1型液相色譜柱溫箱(石家莊萊博瑞分析儀器有限公司)；Venusil C18Plus色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司)；TP502型電子天平(上海菁海儀器有限公司)；FA2104N電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil C18Plus(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：1%乙酸，流動(dòng)相B：100%甲醇，梯度洗脫(0～15 min，75%A；15～16 min，75%A→50%A；16～35 min，50%A；35～36 min，50%A→40%A；36～49 min，40%A；49～50 min，40%A→75%A；50～60 min，75%A)，流速：0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30 ℃[11-13]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g置于燒杯中，加入少量甲醇，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成100 μg/mL的對(duì)照品溶液。槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素的對(duì)照品溶液均按照此方法配制。將配制好的溶液放入4 ℃冰箱冷藏貯存，待用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度梯度，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品溶液的制備

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取同一時(shí)間采集的干燥至恒重的紫葉李葉1.00 g，研磨成細(xì)粉，置于錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液使料液比達(dá)到1∶15，保鮮膜封口，毛細(xì)管扎細(xì)孔，超聲波清洗器預(yù)熱為50 ℃的條件下將錐形瓶放入并保持此溫度，提取60 min，提取完成后，溶液用濾膜過(guò)濾后用甲醇稀釋5倍。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件使用高效液相色譜儀測(cè)定“2.2.1”中不同濃度梯度的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)對(duì)照品溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，繪制4種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

2.3.2 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。精密度試驗(yàn)，取中濃度的混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。重復(fù)性試驗(yàn)，按“2.2.2”項(xiàng)中方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。穩(wěn)定性試驗(yàn)，按“2.2.2”項(xiàng)中方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、3、6、9、12、16、19、21、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD。加樣回收率試驗(yàn)，按“2.2.2”項(xiàng)中方法制備供試品溶液，分別加入折算質(zhì)量為本底量的80%、100%、120%的三種水平的混合對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行做三份，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，計(jì)算4種黃酮類物質(zhì)在不同添加濃度下的平均回收率與RSD。

2.4 提取液中黃酮類物質(zhì)得率的計(jì)算

2.4.1 四種黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定及得率計(jì)算

按“2.2.2”項(xiàng)中方法配制紫葉李葉提取液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定提取液中蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種物質(zhì)的峰面積，通過(guò)“2.3.1”項(xiàng)中的回歸方程分別求出提取液中4種物質(zhì)的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算各物質(zhì)得率。

W=C×N×V/(M×106)×100%

C：各物質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；N：提取液稀釋倍數(shù)；V：稀釋前提取液體積，mL；M：紫葉李葉質(zhì)量，g

2.4.2 黃酮類物質(zhì)得率計(jì)算

根據(jù)蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素4種黃酮類物質(zhì)的生物活性、研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景分別賦予不同權(quán)重，分別為0.1、0.2、0.3、0.4。根據(jù)上述權(quán)重情況計(jì)算黃酮類物質(zhì)的得率，公式為：黃酮類物質(zhì)得率=矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率×0.4+蘆丁得率×0.1+槲皮素得率×0.2+山奈酚得率×0.3。

2.5 單因素試驗(yàn)

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，分別考察液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、提取時(shí)間(30、40、50、60、70 min)對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響。液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間四個(gè)因素的固定水平分別為15∶1、70%、50 ℃、60 min，在對(duì)各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)探究時(shí)，其他因素均取固定水平。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6，運(yùn)用 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，基于單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素及水平見(jiàn)表2。

2.7 紫葉李葉最佳采收月份的確定

使用最佳工藝制備不同月份(4～12月份)紫葉李葉提取液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)“2.4”項(xiàng)中計(jì)算方法計(jì)算出不同月份矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的得率及黃酮類物質(zhì)得率。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)對(duì)4種對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，得到的各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸方程見(jiàn)表3。從計(jì)算結(jié)果來(lái)看，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 4、0.999 3、1.000 0、0.999 3，說(shuō)明此4種物質(zhì)分別在0.010～10、0.025～10、0.010～10、0.025～5 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

3.1.2 方法學(xué)考察結(jié)果

系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，色譜圖見(jiàn)圖1，理論塔板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰計(jì)不低于5 000，分離度大于1.5，分離良好。精密度試驗(yàn)，蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.37%、2.26%、2.66%、2.99%，表明儀器的精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)，蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.56%、2.79%、2.97%、3.13%，表明該方法的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)，蘆丁、槲皮素、山奈酚、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素峰面積RSD分別為1.26%、2.34%、2.76%、3.01%，表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收率試驗(yàn)，4種黃酮類物質(zhì)在三種不同添加濃度下的平均回收率在85.66%～108.07%之間，RSD<2%。.

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms注：對(duì)照品：(A)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素；(B)蘆??；(C)槲皮素；(D)山奈酚。樣品：(E)紫葉李葉提取液：(a)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素；(b)蘆丁；(c)槲皮素；(d)山奈酚。Note:Reference substance:(A) Cyanidin-3-O-glucoside;(B) Rutin;(C) Quercetin;(D) Kaempferol. Sample:(E) Extraction solution of Prunus cerasifera leaves:(a) Cyanidin-3-O-glucoside;(b) Rutin;(c) Quercetin;(d) Kaempferol.

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(A)所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～60%之間時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大為0.098%±0.000 3%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率逐漸降低。液料比對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(B)所示，隨著液料比的增加，黃酮類物質(zhì)得率逐漸增加，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大為0.127%±0.000 5%。之后隨著液料比的增加，黃酮類物質(zhì)得率降低。提取溫度對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(C)所示，提取溫度在30 ℃～50 ℃時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率隨溫度的升高而增加，50 ℃時(shí)黃酮類物質(zhì)得率最大為0.085%±0.000 3%，之后黃酮類物質(zhì)得率隨溫度升高而降低。提取時(shí)間對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響如圖2(D)所示，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)得率先增加后降低。提取時(shí)間為50 min時(shí)黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到最大為0.057%±0.000 2%，提取時(shí)間超過(guò)50 min后黃酮類物質(zhì)得率下降。從上述單因素試驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)其他因素固定時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比，提取溫度和提取時(shí)間分別為60%，20∶1，50 ℃和50 min時(shí)，黃酮類物質(zhì)得率最大。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.2 Effects of ethanol volume fraction,liquid-material ratio,extraction temperature,extraction time on yield of flavonoids注：圖中小寫字母表示單因素試驗(yàn)中具有顯著差異的不同處理組(P<0.05)。Note:Lowercase letters mean a significant difference among the different treatments at P<0.05 level in single factor test.

3.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素為變量，以紫葉李葉提取液中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用 Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸分析，對(duì)自變量A、B、C、D和黃酮類物質(zhì)得率進(jìn)行多元二項(xiàng)式方程擬合。以紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后得到的回歸方程如下。

Y=0.10+5.757×10-3A-1.546×10-3B-5.027×10-3C+2.131×10-3D+7.022×10-3AB-2.687×10-3AC-7.858×10-3AD-2.322×10-4BC-3.168×10-3BD-2.797×10-3CD-6.866×10-3A2-0.011B2-4.608×10-3C2-3.172×10-3D2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。回歸方程顯著性檢驗(yàn)P<0.05，表明模型具有顯著性；失擬項(xiàng)P=0.07>0.05，表明方程擬合程度高，無(wú)明顯失擬存在，此模型成立。根據(jù)表5中F值的大小可以判斷4個(gè)因素對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響程度為：液料比>溫度>時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AB、AD，二次項(xiàng)A2對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響顯著(P<0.05)；二次項(xiàng)B2對(duì)黃酮類物質(zhì)得率具有極顯著的影響(P<0.01)。

表5 方差分析結(jié)果

黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3，響應(yīng)面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度。響應(yīng)面坡度越陡表示兩因素交互作用越大，反之則表示兩因素交互作用不顯著[14]?？稍趫D3(C)中看出，液料比和提取時(shí)間交互項(xiàng)的響應(yīng)面坡度最陡，說(shuō)明兩因素交互作用顯著，而其他因素的交互作用不顯著。與表5方差分析結(jié)果一致。

經(jīng)軟件分析，提取紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時(shí)間41.62 min，預(yù)測(cè)黃酮類物質(zhì)得率為0.105 8%。

3.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

在接下來(lái)的工作中為了便于控制試驗(yàn)條件，將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、液料比25∶1、提取溫度44 ℃、提取時(shí)間42 min。應(yīng)用此條件做3次平行試驗(yàn)，平均黃酮類物質(zhì)得率為0.106 2%±0.000 2%。

圖3 各因素交互作用對(duì)紫葉李葉黃酮類物質(zhì)得率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Responses surface plot showing the interactive effects of different factors on the yield of flavonoids from P. cerasifera leaves

3.4 最佳采收月份的確定

使用軟件分析所得的最佳工藝條件處理不同月份的紫葉李葉，并測(cè)定提取液中黃酮類物質(zhì)得率。不同月份紫葉李葉4種黃酮類物質(zhì)得率變化見(jiàn)圖4(A)。在4～12月份，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素得率呈波浪形變化，在6、8、12月份較高，8～9月份迅速下降；而蘆丁得率總體呈上升趨勢(shì)，7～8月份迅速升高，在11月份達(dá)到峰值，12月份驟降；槲皮素和山奈酚得率受采摘月份影響均不顯著。加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率變化見(jiàn)圖4(B)，在 4～12月份黃酮類物質(zhì)得率總體呈波浪形變化，12月份最高，8月份得率僅次于12月份。

圖4 不同月份紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率Fig.4 The yield of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months注：(A)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)得率；(B)不同月份紫葉李葉中四種黃酮類物質(zhì)經(jīng)加權(quán)后的得率。Note:(A) The yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months;(B) The weighted yield of four kinds of flavonoids in Prunus cerasifera leaves in different months.

4 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)HPLC法中流動(dòng)相的組成進(jìn)行了前期考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-1%乙酸為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定能夠同時(shí)對(duì)4種黃酮類物質(zhì)進(jìn)行很好的分離，且均能達(dá)到對(duì)稱峰型，無(wú)拖尾現(xiàn)象發(fā)生，理論塔板數(shù)較高，亦無(wú)其他色譜峰干擾。同時(shí)，相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]的實(shí)驗(yàn)研究亦表明以甲醇-1%乙酸等為流動(dòng)相的分離度較好，結(jié)果穩(wěn)定，可信度高。因此，本試驗(yàn)最終確定以甲醇-1%乙酸為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

本試驗(yàn)采用Box-Behnken分析方法，探討以紫葉李葉為試驗(yàn)材料，采用超聲波法提取黃酮類物質(zhì)的最佳工藝及其優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)中，采用乙醇溶劑提取，符合黃酮化合物易溶于醇溶劑的特性，同時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加在一定程度上能夠提高黃酮類物質(zhì)得率，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)溶解更多雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)與黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶劑導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的溶解度降低[15,16]；對(duì)液料比而言，液料比的增加在一定程度上能提高黃酮類物質(zhì)得率，當(dāng)液料比增加到一定程度，底物中的其他雜質(zhì)的溶解度也增大，反而會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[15,17]，因此適合的液料比可以有效地溶解黃酮類物質(zhì)，而且不會(huì)造成溶劑的浪費(fèi)；提取溫度方面，適當(dāng)?shù)奶岣邷囟仍谝欢ǔ潭壬夏芴岣唿S酮類物質(zhì)得率，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)氧化以及其他雜質(zhì)溶解度增加，從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低[18,19]；合適的提取時(shí)間可以提高黃酮類物質(zhì)得率，過(guò)長(zhǎng)的提取時(shí)間可以使紫葉李葉中雜質(zhì)也相應(yīng)的溶出，從而會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)得率降低。在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以黃酮類物質(zhì)得率為響應(yīng)值，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間為影響因子設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)曲面試驗(yàn)，對(duì)紫葉李葉黃酮類物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的二次回歸模型相關(guān)性顯著(P<0.05)，準(zhǔn)確度、精密度較高，并得出其最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時(shí)間41.62 min。同時(shí)，還進(jìn)行了相關(guān)的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近且重復(fù)性好，說(shuō)明了響應(yīng)面的Box-Behnken 模型優(yōu)化紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)提取工藝的效果良好，該條件具有實(shí)際意義，將為其進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的含量會(huì)受成熟度、品種、部位、環(huán)境條件、生長(zhǎng)季節(jié)等的影響，其中以隨時(shí)間變化有規(guī)律可循。紫葉李葉中黃酮類成分主要是花色素，根據(jù)史寶勝[20]的研究了解到紫葉李葉花色素含量的變化主要受光照和溫度的影響，當(dāng)溫度在15 ℃時(shí)，相關(guān)酶的活性顯著增強(qiáng)，所以花色素的含量會(huì)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但溫度大于35 ℃時(shí)，酶活性會(huì)受到抑制，花色素的含量會(huì)受到影響，甚至?xí)?dǎo)致花色素的分解。光照對(duì)花色素含量的影響較大，涉及的原因較多，一般是在春秋兩季節(jié)花色素含量較多，夏季含量較少，因此7月份花色素含量下降是合理的。根據(jù)保定市氣象局記錄[21]，保定市的光照強(qiáng)度也呈現(xiàn)波浪式變化，在2～5月呈上升趨勢(shì)，5～7月呈下降趨勢(shì)，而溫度在6月的下半個(gè)月基本上升到30 ℃以上，7月后溫度繼續(xù)升高，甚至?xí)_(dá)到40 ℃的高溫，酶活性嚴(yán)重受到影響。而保定的雨季也基本集中在7、8兩個(gè)月，雨季天空云較多，對(duì)光照也有影響。8～10月光照時(shí)間又是一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)，溫度在9月以后也基本轉(zhuǎn)涼，因此紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)的得率總體呈現(xiàn)波浪形是合理的。

根據(jù)最佳采收月份的試驗(yàn)結(jié)果和上述的分析表明，12月份黃酮類物質(zhì)得率應(yīng)高于8月份得率，但12月份紫葉李葉生長(zhǎng)狀況差，難以大量收集，而8月份紫葉李葉生長(zhǎng)旺盛。綜合考慮不同月份紫葉李葉中4種黃酮類物質(zhì)得率以及加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率動(dòng)態(tài)累積變化情況、紫葉李葉的生長(zhǎng)狀況，最終確定8月份為最佳采收月份。這樣既能保證矢車菊素-3-O-葡萄糖苷花青素、蘆丁、槲皮素、山奈酚4種物質(zhì)得率達(dá)到較高水平，又能保證加權(quán)后的黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到高峰。這與其生長(zhǎng)發(fā)育及所處的月份有關(guān)，而這種變化的機(jī)理有待于進(jìn)一步的深入研究。

本試驗(yàn)所采用的方法學(xué)對(duì)4種黃酮類物質(zhì)的分離良好，且方法重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，具有較好的準(zhǔn)確性。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間 4 個(gè)因素的最佳取值范圍，建立了紫葉李葉中黃酮類物質(zhì)得率的響應(yīng)值與多因素之間的回歸方程模型，確定其最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.93%、液料比25∶1、提取溫度44.08 ℃、提取時(shí)間41.62 min。使用最佳提取工藝處理不同月份紫葉李葉，通過(guò)權(quán)重公式計(jì)算黃酮類物質(zhì)得率，最終確定紫葉李葉最佳采收月份為8月份。該試驗(yàn)對(duì)后期相關(guān)具體成分的提取具有一定的借鑒意義，并對(duì)紫葉李的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有一定的科學(xué)價(jià)值。