大別山白及多糖酶法輔助提取及活性研究

朱富成，羅書嵐，鄭 宣，王 芳，何曉梅，鄧 輝，韓邦興

皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院 安徽省中藥資源保護(hù)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，六安 237012

大別山中藥資源豐富，是野生中藥材道地產(chǎn)區(qū)之一，但中藥資源普查發(fā)現(xiàn)，部分野生中藥如白及受全國(guó)藥材市場(chǎng)影響，野生資源減少速度逐年增加，為加強(qiáng)保護(hù)，皖西學(xué)院對(duì)大別山野生白及進(jìn)行保護(hù)和研究[1]。白及為蘭科白及屬(BletillaRchb. f.)植物白及Bletillastriata(Thunb. ex A. Murray) Rchb.f.的干燥塊莖[2]，研究表明白及塊莖中含有大量天然水溶性多糖，即白及多糖，是白及的主要藥效成分[3]。白及多糖在醫(yī)藥、化妝品及食品領(lǐng)域均有較廣泛的應(yīng)用，且具有無(wú)毒性、生物相容性等特征，使白及多糖備受關(guān)注[4]，然而白及多糖的提取率不高，研究不夠系統(tǒng)廣泛，因此如何高效制備白及多糖是該領(lǐng)域急需解決的關(guān)鍵問題。

根據(jù)已有文獻(xiàn)，目前已有多種新穎提取技術(shù)應(yīng)用于白及多糖提取[5]，如，超聲輔助提取，微波輔助提取，超臨界流體萃取以及紅外輔助提取等方法，每種提取方法在提高提取率的同時(shí)也有各自的缺點(diǎn)，例如需要昂貴的精密設(shè)備，部分提取方法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)會(huì)造成不同程度影響甚至造成多糖降解[6]。因此，開發(fā)簡(jiǎn)便高效的提取方法對(duì)于白及多糖提取極為重要。生物酶(如纖維素酶、果膠酶等)作為高效催化劑，能作用于植物細(xì)胞，增加細(xì)胞通透性，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，研究表明生物酶輔助植物多糖提取可以促進(jìn)提取率[7]。Xia等[8]利用淀粉酶水解提取枸杞多糖，提取率達(dá)到13.2%；Zhu等[9]利用復(fù)合酶制劑酶解靈芝提取多糖，提取率達(dá)到4.4%；Wang等[10]研究纖維素酶酶解荸薺多糖，提取率為32.3%。目前，利用酶法輔助白及多糖的提取仍然鮮有報(bào)道。果膠酶是一種高效生物催化劑，能專一性識(shí)別并作用于植物細(xì)胞壁中的果膠，增加細(xì)胞壁通透性。Song等[11]通過比較幾種酶輔助提取荷蓮葉多糖，發(fā)現(xiàn)果膠酶對(duì)于多糖的結(jié)構(gòu)最具保護(hù)性?；诠z酶的水解選擇性高，作用專一，可以在保護(hù)多糖結(jié)構(gòu)不受破壞的基礎(chǔ)上增加細(xì)胞壁的通透性，進(jìn)而提升多糖的提取率，故在白及多糖的提取研究中具有重要的意義。

本研究通過果膠酶預(yù)處理大別山白，結(jié)合傳統(tǒng)水提方式提取白及多糖，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶預(yù)處理，獲得最優(yōu)白及多糖提取工藝，并進(jìn)而分析果膠酶輔助提取對(duì)多糖天然構(gòu)象影響，研究其體外抗氧化活性。本研究為酶法輔助提取白及多糖奠定基礎(chǔ)，同時(shí)研究結(jié)果對(duì)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要參考意義。

1 材料儀器

1.1 材料與試劑

大別山白及(皖西學(xué)院植物園栽培)；果膠酶(國(guó)藥集團(tuán)，活力單位50 U/g)；葡萄糖；硫酸；苯酚；無(wú)水乙醇；鄰苯三酚(焦性沒食子酸)；鹽酸；鄰二氮菲；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；硫酸亞鐵；雙氧水；氯化鈉；氯化鉀；磷酸二氫鉀；十二水磷酸氫二鈉；均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；SU8010發(fā)射場(chǎng)掃描電鏡(日立有限公司)；TU-1901紫外分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司)。

2 方法

2.1 白及多糖提取

將白及于60 ℃烘干后打粉，并過30目篩，得到固體粉末用石油醚脫脂，并用10 mL/g的95%(V/V)乙醇回流兩次去除寡糖，色素以及其他小分子化合物，經(jīng)過離心過濾后得到產(chǎn)物進(jìn)行真空干燥(40 ℃)獲得預(yù)處理白及粉。稱量一定量的白及粉，加入果膠酶于一定溫度下預(yù)熱一定時(shí)間，80 ℃下熱浴10 min變性果膠酶終止酶解，然后熱水浸提3 h，離心后取上清測(cè)定多糖得率，多糖得率采用苯酚-硫酸法測(cè)定[12]。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化白及多糖提取工藝

設(shè)計(jì)單因素變量，保持其他條件不變，以果膠酶為酶制劑，分別考察酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量對(duì)白及多糖提取率的影響，每個(gè)因素平行測(cè)定3次，取平均值。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken[13]設(shè)計(jì)原理，以酶解時(shí)間(70、80、90 min)、酶解溫度(40、50、60 ℃)、酶添加量(7.5%、10.0%、12.5%)為自變量組合，多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6Trial軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得最優(yōu)酶解提取工藝。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

2.3 白及多糖純化

將提取的白及多糖溶液進(jìn)行真空濃縮至原體積的1/3，利用Sevag試劑(氯仿∶丁醇=4∶1，V/V)脫出蛋白[14]，直到脫出后的液體在260 nm和280 nm處吸收值為0，表明核酸和蛋白已經(jīng)脫完。然后加入無(wú)水乙醇至終濃度為80%(V/V)，靜置24 h，離心過濾獲得多糖沉淀并保存。

2.4 白及多糖掃描電鏡分析

參考已有文獻(xiàn)[15]，白及多糖提取液經(jīng)過冷凍干燥后，利用發(fā)射場(chǎng)掃描電鏡(HITACHI SU8010)分析白及多糖凍干粉的的纖維結(jié)構(gòu)，將白及多糖凍干粉均勻鋪展在試樣架上，利用標(biāo)度尺進(jìn)行掃描觀察，測(cè)定時(shí)的放大倍數(shù)為400倍，加速電位為5.0 kV。

2.5 白及多糖三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道方法[16]，利用剛果紅分析方法測(cè)定白及多糖構(gòu)象結(jié)構(gòu)。向2.0 mL的0.2 mg/mL的白及多糖溶液中加入2.0 mL的100 μmol/L剛果紅溶液。向混合溶液中加入梯度的NaOH溶液(0～0.4 mol/L)。利用紫外分光光度計(jì)(普析通用TU-1901)對(duì)混合溶液進(jìn)行掃描(250～600 nm)，獲得最大吸收峰。其中不含有白及多糖的剛果紅溶液作為空白對(duì)照。

2.6 白及多糖體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.6.1 羥基自由基清除能力測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)體系[17]測(cè)定白及多糖對(duì)羥自由基的清除能力。在20 mL試管中依次加入0.1 moL/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL、5 mmoL/L鄰二氮菲1 mL、1 mmoL/L硫酸亞鐵1 mL、白及多糖樣品液1 mL、1 mL H2O2(1.0%，V/V)，再用0.1 moL/LPBS定容至10 mL，混合溶液在37 ℃水浴中保溫60 min后，于536 nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)2。用1 mL蒸餾水代替1.0%的H2O2，于536 nm處測(cè)得吸光值為A1。用1 mL蒸餾水代替多糖樣品液，于536 nm處測(cè)得吸光值為A0。用2 mL蒸餾水代替多糖樣品液和H2O2為空白對(duì)照。經(jīng)計(jì)算獲得羥自由基清除率。

2.6.2 白及多糖對(duì)超氧陰離子清除能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[18]測(cè)定白及多糖對(duì)超氧陰離子的清除率。在20 mL試管中，加入pH8.2、0.1 moL/L Tris-HCL 4.5 mL，再加入4.2 mL蒸餾水，混勻后于25 ℃水浴中保溫20 min，加入預(yù)熱的4 mmoL/L鄰苯三酚0.3 mL，混勻后于325 nm處測(cè)定吸光值，每過20 s記錄一次吸光值，共記錄3 min，繪制鄰苯三酚自氧化曲線，曲線斜率為A1。用相應(yīng)體積的蒸餾水代替鄰苯三酚為空白對(duì)照管。用1 mL不同濃度的白及多糖樣品液依次代替1 mL蒸餾水，繪制曲線，曲線斜率為A0。經(jīng)計(jì)算獲得超氧陰離子清除率。

2.6.3 白及多糖對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)已有文獻(xiàn)[19]，分別取2 mL不同濃度的白及多糖樣品液置于試管中，加入2 mL的DPPH(0.1 mmoL/L)溶液，混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，取上清于517 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。同時(shí)測(cè)定2 mL乙醇代替2 mL樣品的吸光值A(chǔ)2以及2 mL水代替2 mL DPPH的吸光值A(chǔ)0。按下式計(jì)算白及多糖對(duì)DPPH的清除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素對(duì)白及多糖提取率的影響

酶的添加量可以決定酶活力，因此對(duì)白及多糖的提取具有較大影響，大量的添加酶量可以促進(jìn)提取率，但是將會(huì)增加提取成本，同時(shí)大量的酶蛋白存在也將會(huì)增加去除的難度，因此加酶量對(duì)白及多糖影響十分必要。如圖1A所示，白及多糖提取率隨果膠酶添加量增加而提高，在12.5%～20.0%之間提取率趨于穩(wěn)定。因此，結(jié)合酶制劑的實(shí)際情況，為了把成本降到最低，選擇酶添加量為7.5%、10.0%、12.5%三水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

溫度對(duì)酶活力影響較大，因此分析溫度對(duì)白及多糖酶法提取十分重要。如圖1B所示，白及多糖提取率隨溫度的升高而提高，并在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為62.3%。再升高溫度，白及多糖提取率反而下降。這可能是由于溫度過高，果膠酶發(fā)生失活，導(dǎo)致酶活性降低，從而提取率下降。綜合考慮，選擇酶解溫度為40、50、60 ℃三水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

酶解時(shí)間對(duì)白及多糖提取率影響如圖1C所示。白及多糖提取率隨時(shí)間的增長(zhǎng)而提高，并在80 min到達(dá)最大值，為63.0%。酶解時(shí)間再加長(zhǎng)，白及多糖提取率反而下降，可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)，果膠酶微弱水解白及多糖，致使得率有所降低。綜合考慮，選擇酶解時(shí)間為70、80、90 min三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

3.2 基于響應(yīng)面優(yōu)化白及多糖的提取

響應(yīng)面法被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的優(yōu)化處理，該方法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)合理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點(diǎn)，所以本研究根據(jù)單因素確定的最佳水平，以白及多糖提取率為響應(yīng)值，做Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，如表2所示。利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得白及多糖提取率(Y)對(duì)酶添加量(A)、酶解溫度(B)和酶解時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=63.77+2.57A+0.92B+1.16C-0.020AB+0.20AC-0.080BC-2.01A2-2.12B2-3.40C2，各因素交互作用結(jié)果如圖2所示。

圖1 單因素對(duì)白及多糖提取率的影響Fig.1 The effect of single factor on extraction rate of BSP

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及多糖得率

對(duì)獲得的相應(yīng)曲面進(jìn)行回歸線性系數(shù)的顯著性分析，如表3所示，影響因素A影響極顯著；B和C影響顯著，即酶添加量對(duì)酶法輔助提取白及多糖提取率有著極其顯著的影響，酶解時(shí)間和酶解溫度有著顯著的影響關(guān)系，且影響顯著順序?yàn)锳>C>B。二次項(xiàng)A2、B2、C2影響均為極顯著；交互項(xiàng)中均影響不顯著，這說明白及多糖提取率與各個(gè)因素之間不單單是線性關(guān)系。此外，試驗(yàn)整體模型的P= 0.000 7 < 0.01，表明模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)的P=0.656 3>0.05，表明模型失擬不顯著。R2= 0.953 3，說明該模型能解釋95.33%的響應(yīng)值的變化。由此可見，利用Design-Expert 8.06軟件得到的二元多項(xiàng)回歸方程及其顯著性分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用此模型分析白及多糖酶提工藝結(jié)果。

表3 顯著性及方差分析

通過響應(yīng)面法分析得到白及多糖酶提工藝的最優(yōu)條件為：果膠酶添加量12.5%、酶解溫度51.5 ℃、酶解時(shí)間81.8 min，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)條件的操作，可將最佳條件修改為果膠酶添加量12%、酶解溫度52 ℃、酶解時(shí)間82 min，在此工藝下，白及多糖提取率為64.8%。采用酶法提取獲得的白及多糖提取率明顯高于利用傳統(tǒng)水提的效率[20]以及微波輔助提取白及多糖的效率[21]。本研究通過響應(yīng)曲面優(yōu)化酶法提取白及多糖的得率是目前已報(bào)道最高提取率，本方法的開發(fā)為白及多糖進(jìn)一步開發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的依據(jù)。

圖2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化優(yōu)化白及多糖提取率Fig.2 The response surface method was used to optimize the polysaccharide extraction

3.3 白及多糖構(gòu)象

考慮到果膠酶可能對(duì)白及多糖發(fā)生酶催化作用，破壞其天然構(gòu)象，因此本研究進(jìn)一步分析了提取的白及多糖的構(gòu)象。剛果紅試劑可以與多糖的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)形成復(fù)合物使得最大吸收值會(huì)發(fā)生紅移，當(dāng)三鏈螺旋發(fā)生解鏈變成單鏈時(shí)，剛果紅-多糖復(fù)合物的最大吸收值會(huì)降低。分析多糖在不同濃度的NaOH溶液中的最大吸收值的變化將有助于分析多糖的構(gòu)型[15]。如圖3所示，含有白及多糖的剛果紅溶液最大吸收波長(zhǎng)比剛果紅空白對(duì)照大，表明白及多糖可以使得吸收值發(fā)生紅移，表明在498～487 nm波長(zhǎng)下白及多糖三股螺旋與剛果紅絡(luò)合物形成。當(dāng)NaOH濃度超過0.4 mol/L后，含有白及多糖的剛果紅溶液最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯的藍(lán)移，表明高濃度的NaOH導(dǎo)致白及多糖構(gòu)象發(fā)生去折疊，由三股螺旋演變?yōu)閱捂?。本研究中的?gòu)象分析結(jié)果與前人報(bào)道通過微波輔助白及多糖提取保持天然構(gòu)象的結(jié)果一致[21]，表明本研究中提取的白及多糖形成了三股螺旋的天然構(gòu)象，說明本實(shí)驗(yàn)提取的白及多糖構(gòu)象沒有收到果膠酶破壞。

圖3 白及多糖在不同濃度NaOH種構(gòu)型轉(zhuǎn)變分析Fig.3 Conformation transition analysis of BSP at different concentration of NaOH.

3.4 掃描電鏡分析

如圖4所示，本研究中提取的多糖微觀結(jié)構(gòu)在掃描電鏡下呈現(xiàn)一定的孔狀結(jié)構(gòu)，與Qu等[21]報(bào)道的微波輔助法提取的多糖相比，電鏡結(jié)構(gòu)更為致密。這一結(jié)果進(jìn)一步說明在酶法輔助提取中果膠酶沒有破壞白及多糖；與微波輔助提取相比，酶法提取對(duì)白及多糖的保護(hù)性更好。

圖4 白及多糖在掃描電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 SEM images of BSP micro-structure

3.5 白及多糖體外抗氧化研究

羥基自由基、DPPH以及超氧陰離子均是活性很強(qiáng)的自由基，可損傷體內(nèi)多種蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子，對(duì)人體健康不利，因此，對(duì)這三種物質(zhì)的清除可以有效表征其抗氧化活性[22]。本研究采用Fenton反應(yīng)體系檢測(cè)白及多糖對(duì)羥自由基的清除能力，結(jié)果如圖5A。由圖5A分析可知白及多糖對(duì)羥自由基有顯著的清除能力，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系，清除率隨著白及多糖濃度的增加而升高，白及多糖濃度為15 mg/mL時(shí)，清除率為87.6%。本研究白及多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果如圖5B。分析圖5B可知，白及多糖對(duì)DPPH有很強(qiáng)的清除作用，且在1～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，白及多糖對(duì)DPPH的清除率隨多糖濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時(shí)，白及多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為83.9%。實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定白及多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力，結(jié)果如圖5C。由圖分析可知白及多糖對(duì)超氧陰離子具有明顯清除作用，且在白及多糖濃度為1～10 mg/mL時(shí)，表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系，隨著樣品質(zhì)量濃度升高其清除能力增強(qiáng)，當(dāng)白及多糖濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基清除率最大，為71.5%。實(shí)驗(yàn)表明本研究的白及多糖對(duì)羥自由基、DPPH及超氧陰離子的清除作用具有清除率高、效果穩(wěn)定的特點(diǎn)。

部分研究報(bào)道表明白及多糖可以在較低多糖濃度下(如0.5 mg/mL)展現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性[22]，但本研究結(jié)果表明為本實(shí)驗(yàn)所提取白及多糖在10 mg/mL以上濃度時(shí)才可以表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化活性，該結(jié)果與Yang等[23]報(bào)道表現(xiàn)一致。

4 結(jié)論

現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)果膠酶輔助提取白及多糖工藝及其抗氧化活性研究鮮有報(bào)道。本研究采用果膠酶輔助法提取白及多糖，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝。在最優(yōu)條件下，白及多糖提取率達(dá)到64.8%，為目前最高報(bào)道量。通過對(duì)白及多糖空間構(gòu)象分析及電鏡觀察表明果膠酶提取對(duì)白及多糖具有較好的保護(hù)作用。體外性質(zhì)研究表明，白及多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子、DPPH自由基均有很強(qiáng)的清除能力。綜上，本研究首次報(bào)道果膠酶輔助提取白及多糖的工藝優(yōu)化及體外活性，本研究為白及多糖的工業(yè)化應(yīng)用提供了良好的參考條件。

圖5 不同濃度的白及多糖抗氧化性測(cè)定Fig.5 Resistance to oxidation analysis of different concentration of BSP