藏藥材訶子中3種α-葡萄糖苷酶抑制劑的分離與鑒定

馬家麟，陳 濤，譚 亮，王 環(huán)，李玉林

中國科學(xué)院西北高原生物研究所 中國科學(xué)院三江源國家公園研究院，西寧 810008

α-葡萄糖苷酶是與糖尿病密切相關(guān)的酶之一，對(duì)碳水化合物的代謝至關(guān)重要，α-葡萄糖苷酶抑制劑能通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶的活性從而延緩碳水化合物的吸收，降低餐后和空腹的血糖水平[1-3]，有效控制病情發(fā)展。目前市場(chǎng)上使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要分為人工合成和天然來源兩大類，人工合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑如阿卡波糖等有腹瀉、腹脹痛、肝腎損傷等副作用，嚴(yán)重阻礙了其廣泛應(yīng)用[4]。而天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有療效穩(wěn)定、安全、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)，是現(xiàn)代醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5,6]。

訶子為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.)或絨毛訶子(T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt)的干燥成熟果實(shí)，規(guī)肺，大腸經(jīng)[7]，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽等功效[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，訶子具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、強(qiáng)心等藥理作用[9]，而且，訶子所含的酚酸類物質(zhì)在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出良好的抗糖尿病活性[10,11]，這表明訶子可能含有潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

目前關(guān)于訶子提取物中的抗糖尿病活性的成分的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，因此，亟需深入研究建立高效的檢測(cè)技術(shù)，從訶子中篩選分離天然α-葡萄糖苷酶抑制劑。

1 材料與儀器

1.1 材料

訶子藥材采購自青海省西寧市八一路藏藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所孫菁研究員鑒定為訶子(TerminaliachebulaRetz.)干燥果實(shí)。

1.2 試劑

酵母中的α-葡萄糖苷酶(美國西格瑪-奧德里奇公司)；阿卡波糖(德國拜耳公司)；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，美國西格瑪-奧德里奇公司)；D101、HPD-600、S-8、X-5、AB-8、D3520大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；用于高效液相色譜分析的甲醇為色譜純；用于大孔吸附樹脂分離的乙醇和半制備高效液相色譜的甲醇為分析純；二甲基亞砜及方法中各化學(xué)試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.3 儀器

LC-8A半制備高效液相色譜(SPD-20A紫外可見光檢測(cè)器，日本島津公司)；Dubhe C18柱(250 mm× 10 mm，10 μm)；Aglient 1260系列高效液相色譜儀(G1315D紫外可見光二極管陣列檢測(cè)器，美國Aglient公司)；Dikma Platisil ODS-C18分析柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；安亭TGL-16C系列離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；10 kDa超濾離心管(德國Merck公司)；Varian Mercury-400B核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；Varian Cary 300紫外可見分光光度計(jì)(美國Varian公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 訶子提取物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選

2.1.1 樣品前處理

清除訶子藥材表面灰塵雜質(zhì)，稱取1.0 kg粉碎過40目篩的訶子粉末，料液比1∶15(V/V)加入75%乙醇加熱回流提取1 h，過濾，藥渣再加入75%乙醇15 L，反復(fù)提取3次，合并濾液，減壓濃縮蒸干，得到訶子粗提物約210 g，冷藏備用。

2.1.2 超濾技術(shù)篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑

精密稱取50.0 mg訶子粗提物至50 mL容量瓶中，加水溶解后定容至刻度，搖勻。用0.45 μm濾膜過濾，即得。分別準(zhǔn)確移取250 μL供試品溶液和50 μL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶至10 mmol/L醋酸銨緩沖液(pH6.8)中，37 ℃反應(yīng)30 min。然后移取100 μL混合溶液至10 kDa的超濾離心管中，在10 000 rpm下離心15 min，用10 mmol/L醋酸銨緩沖液離心清洗濾液三次，每次100 μL，以除去游離成分，未被濾過的成分用于液相色譜分析。

2.1.3 色譜分析條件

色譜柱：Dikma Platisil ODS-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%乙酸-水溶液(A相)，甲醇(B相)，梯度洗脫(0～30 min，30%→70%B)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 大孔吸附樹脂富集訶子中α-葡萄糖苷酶抑制劑

2.2.1 大孔吸附樹脂的選擇

考察6種大孔吸附樹脂(D101、HPD-600、S-8、X-5、AB-8和D3520)的對(duì)目標(biāo)化合物的富集效果。將大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，再用大量去離子水沖洗至流出液無醇味。然后依次用4%鹽酸溶液、去離子水和4%氫氧化鈉溶液各清洗一次，最后用去離子水沖洗至流出液呈中性，處理好的樹脂晾干備用。

2.2.2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

分別稱取預(yù)處理后的6種大孔吸附樹脂2.0 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，各加入訶子粗提物樣品溶液(20 mg/mL)25 mL，密封后于室溫條件下以120 rpm轉(zhuǎn)速振搖12 h使吸附完全，過濾，定容至25 mL，測(cè)定反應(yīng)前后目標(biāo)化合物的峰面積，按式(1)計(jì)算吸附率。過濾后，干燥固體樹脂，收集備用。

Q=(P1-P2)/P1×100%

(1)

其中，Q為吸附率；P1為吸附前樣品溶液中目標(biāo)化合物峰面積；P2為吸附后溶液中目標(biāo)化合物峰面積。

2.2.3 靜態(tài)解吸附試驗(yàn)

將靜態(tài)吸附后得到的6種樹脂分別置于50 mL具塞錐形瓶中，各加95%乙醇溶液25 mL，密封后于室溫條件下以120 rpm轉(zhuǎn)速振搖12 h使解吸附完全，過濾，定容至25 mL，測(cè)定溶液中目標(biāo)化合物的峰面積，按式(2)計(jì)算解析率。

D=P3/P1×100%

(2)

其中，D為解析率；P1為解吸附前樣品溶液中目標(biāo)化合物峰面積；P3為解吸附后溶液中目標(biāo)化合物峰面積。

2.3 分離條件優(yōu)化

2.3.1 洗脫劑濃度考察

取用“2.2”中選定的大孔樹脂，濕法裝柱，測(cè)定柱體積為200 mL，注入100 mL訶子粗提物樣品溶液，靜置24 h，分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇溶液沖洗大孔樹脂柱，每個(gè)濃度均沖洗5倍柱體積，收集洗脫液，用高效液相色譜法測(cè)定每個(gè)洗脫組分中目標(biāo)化合物的峰面積。

2.3.2 洗脫體積考察

取用“2.2”中選定的大孔樹脂，濕法裝柱，測(cè)定柱體積為200 mL，注入100 mL訶子粗提物樣品溶液，靜置24 h。首先用30%乙醇洗脫大孔樹脂柱，除去非目標(biāo)組分，采用高效液相色譜法測(cè)定每個(gè)洗脫體積中目標(biāo)化合物的峰面積，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線確定洗脫體積。然后，采用50%乙醇溶液洗脫大孔樹脂柱，富集目標(biāo)化合物，用高效液相色譜法測(cè)定每個(gè)洗脫體積中目標(biāo)化合物的峰面積，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線確定洗脫體積。

2.4 目標(biāo)化合物的純化與鑒定

2.4.1 半制備高效液相色譜分析條件

色譜柱：Dubhe C18柱(250 × 10 mm，10 μm)；0.1%乙酸(A相)，甲醇(B相)；梯度洗脫(0～50 min，20%→70%B)；流速：4.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：5 mL。

2.4.2 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)鑒定

將半制備高效液相色譜分離得到的3個(gè)組分用二甲基亞砜溶解，以TMS為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)核磁共振1H NMR 和13C NMR波譜數(shù)據(jù)鑒定3個(gè)組分結(jié)構(gòu)。

2.5 訶子中目標(biāo)化合物的α-葡萄糖苷酶體外抑制活性檢測(cè)

活性檢測(cè)反應(yīng)體系配制如下[12,13]：取0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.8)30 μL，分別加入二甲基亞砜5 μL和0.1 U/mLα-葡萄糖苷酶10 μL，37 ℃反應(yīng)10 min，加入1.0 mmol/L pNPG 10 μL，37 ℃反應(yīng)15 min，再加入0.1 mol/L Na2CO3溶液45 μL終止反應(yīng)，混勻后，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值，每個(gè)化合物3次平行實(shí)驗(yàn)。以對(duì)α-葡萄糖苷酶有顯著抑制作用的阿卡波糖作為陽性對(duì)照，按照I=[1-(A樣品組-A樣品空白組)/(A陰性組-A空白組)]×100%，計(jì)算抑制率I，并用Origin軟件計(jì)算IC50值。

3 結(jié)果與分析

3.1 訶子提取物中α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選

液相檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，a為訶子提取物溶液(對(duì)照組)；b為與α-葡萄糖苷酶超濾親和后的混合液(試驗(yàn)組)。由圖可見，實(shí)驗(yàn)組混合液中主要含有的化合物為1～3，說明這3個(gè)化合物與α-葡萄糖苷酶發(fā)生特異性結(jié)合，未透過超濾膜，因此，以上3個(gè)化合物被認(rèn)為是α-葡萄糖苷酶抑制劑，而其他化合物沒有α-葡萄糖苷酶抑制活性。以化合物1～3作為目標(biāo)化合物，對(duì)其進(jìn)行分離制備。

圖1 對(duì)照組(a)和試驗(yàn)組(b)液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the control sample (a) and the experimental sample (b)

3.2 大孔吸附樹脂富集訶子中α-葡萄糖苷酶抑制劑

3.2.1 大孔吸附樹脂的選擇

由圖2可知，在考察的D101、HPD-600、S-8、X-5、AB-8和D3520 6種大孔吸附樹脂中，AB-8和X-5樹脂的吸附性能優(yōu)于其它樹脂。由圖3可知，AB-8和D101樹脂的解吸率高于其他樹脂。因此，AB-8大孔吸附樹脂對(duì)于目標(biāo)化合物的吸附和解吸附能力均有良好表現(xiàn)，選擇AB-8樹脂進(jìn)行后續(xù)的分離。

圖2 6種樹脂對(duì)化合物1～3的吸附率考察Fig.2 Adsorption ratio of compounds 1-3 on different macroporous resin

圖3 6種樹脂對(duì)化合物1～3的解析率考察Fig.3 Desorption ratio of compounds 1-3 on different macroporous resin

3.2.2 分離條件優(yōu)化

由表1可知，目標(biāo)化合物主要分布在40%乙醇中。30%乙醇中的化合物1峰面積占比為12.92%，50%乙醇中的化合物2峰面積占比為10.41%。因此，有必要選擇合適體積的30%乙醇去除雜質(zhì)，再用40%乙醇洗脫目標(biāo)化合物。

用30%乙醇洗脫目標(biāo)化合物時(shí)，洗脫曲線如圖4所示。結(jié)果表明：當(dāng)洗脫體積從4 BV增加到5 BV時(shí)，洗脫液中化合物1的峰面積明顯增高，因此，選擇使用4 BV 30%乙醇去除非目標(biāo)化合物。然后，用40%乙醇溶液洗脫目標(biāo)物，洗脫曲線見圖5。結(jié)果表明：當(dāng)洗脫體積增加到8 BV時(shí)，洗脫液中化合物3的峰面積變化趨近于零。因此，選擇7 BV 40%乙醇溶液洗脫目標(biāo)物。

表1 3種組分在不同濃度洗滌液中的含量

圖4 不同柱體積的30%乙醇對(duì)化合物1的洗脫曲線Fig.4 The elution curve of compound 1 on AB-8 column

圖5 不同柱體積的50%乙醇對(duì)化合物3的洗脫曲線Fig.5 The elution curve of compound 3 on AB-8 column

選擇AB-8樹脂對(duì)訶子粗提物中3種α-葡萄糖苷酶抑制劑進(jìn)行富集，采用優(yōu)化后的條件，從113 g訶子粗提物中得到34.6 g淡黃色粉末狀提取物，得率為30.6%。訶子提取物中目標(biāo)化合物的峰面積比分別由15.8%、19.1%和11.2%，提高至29.6%、40.3%和21.9%，提取率平均增加了2倍，化合物純度顯著提高，為后續(xù)目標(biāo)物純化工作奠定了基礎(chǔ)。

3.3 目標(biāo)化合物的純化與鑒定

3.3.1 目標(biāo)化合物的純化

由半制備高效液相色譜儀對(duì)大孔樹脂富集產(chǎn)物進(jìn)行分離，并采集各目標(biāo)組分，減壓蒸干，從100 mg樣品中得到化合物1(27 mg)、化合物2(35 mg)和化合物3(22 mg)，3個(gè)化合物純度分別為96.6%、98.1%和96.4%。

3.3.2 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；易溶于甲醇，微溶于水，不溶于乙酸乙酯、苯、丙酮、氯仿；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.49(1H，s，H-1)，5.39(1H，brs，H-2)，5.82(1H，brs，H-3)，5.23(1H，d，J=3.0 Hz，H-4)，4.83(1H，t，J=17.4 Hz，H-5)，4.37(1H，dd，J=10.2，7.8 Hz，H-6a)，4.90(1H，t，J=20.3 Hz，H-6b)；4.79(1H，d，J=7.2 Hz，H-2′)，5.04(1H，dd，J=7.3，1.2 Hz，H-3′)，3.80(1H，m，H-4′)，2.15(1H，m，H-5′)，7.48(1H，s，H-2″)；7.07(2H，s)；6.84(2H，s)；6.63(2H，s)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：91.1(C-1)，69.7(C-2)，61.0(C-3)，65.6(C-4)，72.9(C-5)，63.3(C-6)；169.4(C-1′)，65.4(C-2′)，40.3(C-3′)，38.6(C-4′)，29.2(C-5′)，173.6(C-6′)，173.0(C-7′)，114.8(C-1″)，117.6(C-2″)，116.2(C-3″)，146.0(C-4″)，139.0(C-5″)，140.0(C-6″)，165.0(C-7″)；118.7(C-1″′)，109.5(C-2″′，6″′)，145.1(C-3″′，5″′)，139.5(C-4″′)，164.9(C-7″′)；114.6(C-1)，124.2(C-2)，106.8(C-3)，144.8(C-4)，136.2(C-5)，143.9(C-6)，168.7(C-7)；116.3(C-1′)，123.1(C-2′)，109.1(C-3′)，144.2(C-4′)，137.3(C-5′)，144.1(C-6′)，166.1(C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物1為訶黎勒酸(見圖6-1)。

化合物2白色粉末，易溶于甲醇，微溶于水，不溶于乙酸乙酯、苯、丙酮，氯仿。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.49(1H，d，J=2.9 Hz，H-1)，5.42(1H，brs，H-2)，6.25(1H，brs，H-3)，5.04(1H，d，J=3.0 Hz，H-4)，4.72(1H，dddd，J=7.8，6.6，1.1，1.0 Hz，H-5)，4.61(1H，dd，J=10.9，6.6 Hz，H-6a)，4.79(1H，dd，J=11.0，7.8 Hz，H-6b)；4.80(1H，d，J=7.1 Hz，H-2′)，5.06(1H，dd，J=7.2，1.3 Hz，H-3′)，3.87(1H，ddd，J=10.7，4.2，1.4 Hz，H-4′)，2.22(1H，m，H-5′a)，2.24(1H，m，H-5′b)，7.51(1H，s，H-2″)；7.11(2H，s)；7.16(2H，s)；6.98(2H，s)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：91.6(C-1)，70.8(C-2)，61.7(C-3)，68.1(C-4)，74.9(C-5)，63.8(C-6)；169.4(C-1′)，65.8(C-2′)，40.4(C-3′)，39.1(C-4′)，30.1(C-5′)，174.6(C-6′)，173.3(C-7′)，117.6(C-1″)，116.2(C-2″)，146.0(C-3″)，139.2(C-4″)，140.1(C-5″)，115.0(C-6″)，164.7(C-7″)；118.6(C-1″′)，109.3(C-2″′，6″′)，145.2(C-3″′，5″′)，139.4(C-4″′)，164.9(C-7″′)； 118.5(C-1″′)，109.4(C-2″′，6″′)，145.3(C-3″′，5″′)，139.4(C-4″′)，164.8(C-7″′)；119.3(C-1″′)，110.4(C-2″′，6″′)，145.0(C-3″′，5″′)，138.7(C-4″′)，166.5(C-7″′)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物2為訶子酸(見圖6-2)。

化合物3黃色粉末，易溶于甲醇，微溶于水。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.45(2H，s，H-5/H-5′)，4.80(2H，br，H-6/H-6′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：107.7(C-5)，110.3(C-6)，112.3(C-1)，136.4(C-2)；139.5(C-3)，148.1(C-4)，159.1(C-7)。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物3為鞣花酸(見圖6-3)。

3.4 訶子中目標(biāo)化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測(cè)

由表2可知，與陽性對(duì)照阿卡波糖比較，從訶子中分離得到的3種α-葡萄糖苷酶抑制劑均表現(xiàn)出良好的抑制活性，其中，訶黎勒酸和訶子酸抑制作用最強(qiáng)，其IC50分別為39.2±0.7，35.8±0.4 mg/L，抑制率分別達(dá)到95.9%、98.3%。

圖6 化合物1～3的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 The chemical structures of compound 1-3

表2 α-葡萄糖苷酶抑制活性

4 結(jié)論與討論

經(jīng)α-葡萄糖苷酶反應(yīng)后，藥材提取物中具有親和活性的化合物配體與α-葡萄糖苷酶結(jié)合成大分子量的混合物，其他沒有親和力的化合物則處于小分子游離狀態(tài)。使混合溶液通過超濾膜時(shí)，與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的配體化合物將無法通過濾膜，而游離態(tài)的化合物被濾過，未透過濾膜的物質(zhì)經(jīng)高效液相色譜分析，對(duì)比提取物液相色譜圖，觀察化合物峰面積變化，即可以達(dá)到快速篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的目的。

訶子是最常用的藏藥，在藏藥學(xué)經(jīng)典著作《晶珠本草》里，訶子被稱為“藏藥之王”，其活性成分主要是鞣質(zhì)、酚酸、三萜類、黃酮類物質(zhì)[10]。本文以訶子為研究目標(biāo)，首次采用超濾高效液相色譜法、大孔樹脂法、半制備高效液相色譜法結(jié)合核磁共振色譜法快速篩選、分離和鑒定出訶子中3種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分，最終鑒定這3種化合物分別為訶黎勒酸、訶子酸和鞣花酸?；钚詸z測(cè)結(jié)果顯示，這3種酚酸類成分能與α-葡萄糖苷酶高效結(jié)合，顯示該化合物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，表明訶子中存在具有糖尿病治療藥物開發(fā)潛力的成分，為開發(fā)基于訶子的降糖藥物提供了科學(xué)參考依據(jù)。