大白菜的化學(xué)成分研究

王 涵，司函瑞，焦玉鳳，劉金平，李平亞

吉林大學(xué)藥學(xué)院 吉林大學(xué)天然藥物研究中心，長春 130021

大白菜(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)為十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassicas)二年生草本植物，又名結(jié)球白菜、黃芽菜，原產(chǎn)于中國[1,2],最早歷史記載始于西晉，古時(shí)稱之為“菘”。大白菜中含有多種微量元素、維生素、無機(jī)鹽、纖維素、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖苷、黃酮、生物堿、三萜皂苷、揮發(fā)油等成分[3,4]，民間有“百菜不如白菜”的說法，可見大白菜在居民蔬菜供應(yīng)中占有重要地位。元代食療專著《飲膳正要》記載其“通利腸胃，除胸中煩，解酒毒”。清代《本草綱目拾遺》記載：“白菜汁，甘溫?zé)o毒，利腸胃，除胸?zé)?，解酒渴，利大小便，和中止嗽”且“冬汁尤佳”。可緩解肺熱、咳嗽、咽干、口渴、頭痛、大便干結(jié)、丹毒、痔瘡出血等病癥[5,6]，是清涼降瀉兼補(bǔ)益之良品，適合大部分人群食用。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)大白菜的研究以栽培育種以及防蟲害為主，對(duì)其化學(xué)成分的提取分離鮮有報(bào)道，為進(jìn)一步明確大白菜中的化學(xué)成分，以期為其食用價(jià)值和藥用價(jià)值提供參考依據(jù)，本課題組對(duì)吉林產(chǎn)大白菜的化學(xué)成分進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

大白菜于 2017年10月采購自吉林省長春市，由吉林大學(xué)藥學(xué)院李平亞教授鑒定為十字花科蕓薹屬植物大白菜(BrassicarapaL.ssp.pekinensis)。

Xevo G2-XS QTOF四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Waters公司);Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司);Acquity UPLC BEH C18色譜柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司);半制備高效液相色譜儀(Waters 1525二元 HPLC泵，Waters 2998二極管陣列檢測器);SunFire Prep C18半制備色譜柱(10 mm×150 mm，10 μm，美國Waters公司);Bruker DRX 500、600核磁共振波譜儀(美國Bruker公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);DLSB低溫冷卻液循環(huán)泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);Spectrumlab暗箱式紫外分析儀(上海棱光技術(shù)有限公司);FA1104N電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);RCT-3200超純水儀(長春博萊帕特科技發(fā)展有限公司);KQ-100數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);柱色譜硅膠(青島鑫昶來硅膠有限公司);TLC硅膠板(青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司);反相C18硅膠(梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司);Sephadex LH-20(上海伊卡生物技術(shù)有限公司);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher 公司);正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇(分析純，北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司);無水乙醇(工業(yè)級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇、三氯甲烷、吡啶、二甲基亞砜(氘代試劑，上海思域化工科技有限公司)。

Hep-2 細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院);RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司);二甲亞砜(DMSO)、青霉素和鏈霉素(上海鼎國生物技術(shù)有限公司);MTT(美國 Sigma 公司)。MCO-20AIC CO2培養(yǎng)箱(中國Sanyo公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

取新鮮白菜102 kg，剁碎，以5倍體積量的95%乙醇室溫浸泡3次，第1次浸泡48 h，其余2次各浸泡24 h，合并3次浸泡所得提取液，過200目篩，所得濾液通過減壓回收溶劑得到稠膏，將稠膏溶解于2 000 mL水中，依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并各部分萃取液，減壓回收溶劑，干燥后得正己烷萃取物5.6 g，二氯甲烷萃取物12.2 g，乙酸乙酯萃取物 25.9 g，正丁醇萃取物260.2 g。

正己烷萃取物(5.6 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，采用正己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)(200∶1→0∶100)梯度洗脫，得到3個(gè)組分，其中Fr.1中結(jié)晶得到化合物1(5 mg)。

二氯甲烷萃取物(12.2 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，采用正己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)(200∶1→0∶100)梯度洗脫，得到5個(gè)組分，其中Fr.1中結(jié)晶得到化合物12(2mg).

乙酸乙酯萃取物(25.9 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，以正己烷-乙酸乙酯系統(tǒng)(30∶1→0∶1)和氯仿甲醇系統(tǒng)(10∶1→1∶1)梯度洗脫，得到5個(gè)組分，其中Fr.2結(jié)晶得到化合物6(10 mg)，F(xiàn)r.3經(jīng)Sephadex LH-20和半制備液相以及重結(jié)晶得到化合物7(3 mg)，F(xiàn)r.3經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜和Sephadex LH-20得到化合物8(5 mg)。

正丁醇萃取物(124.2 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，以氯仿甲醇系統(tǒng)(100∶1→1∶1)梯度洗脫，得到12個(gè)組分，F(xiàn)r.1經(jīng)正相硅膠柱色譜和反向硅膠柱色譜得到化合物2(7 mg)、14(5 mg)，F(xiàn)r.2經(jīng)正相硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜和半制備液相得到化合物10(2mg)、9(2 mg)、15(2 mg)，F(xiàn)r.3經(jīng)正相硅膠柱色譜和半制備液相得到化合物11(2 mg)，F(xiàn)r.7經(jīng)Sephadex LH-20和半制備液相得到化合物4(5 mg)、5(2 mg)，F(xiàn)r.19經(jīng)正相硅膠柱色譜和反向硅膠柱色譜得到化合物13(3 mg)，F(xiàn)r.10經(jīng)結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù)得到化合物3(512 mg)。

2.2 藥理活性篩選

用MTT法檢測該化合物對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的抑制作用，將喉癌Hep-2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于96孔板內(nèi)(體積為100 μL/孔，每孔細(xì)胞約1×105個(gè)/mL)，設(shè)相應(yīng)濃度的溶媒對(duì)照孔及調(diào)零孔，然后加入不同濃度的藥物，給藥濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25 μM，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物與細(xì)胞共同孵育24 h后用MTT法檢測細(xì)胞生長情況。吸盡培養(yǎng)基后，每孔加入90 μL無血清培養(yǎng)基，除空白孔外，每孔加入MTT 10 μL，置培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，吸盡培養(yǎng)基后，每孔加入100 μL DMSO混勻后充分吹打，使紫色結(jié)晶完全溶解后測定570 nm處的OD值。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(用藥組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色晶體(甲醇);10% 硫酸-乙醇溶液顯紫紅色，Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，Molish反應(yīng)呈陰性。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，m，H-1)為烯氫信號(hào)，3.55(1H，m，H-3)為連氧氫信號(hào)，1.03(3H，s，19-CH3)，0.95(3H，d，J=1.0 Hz，21-CH3)，0.87(3H，m，26-CH3)，0.85(3H，m，29-CH3)，0.83(3H，m，27-CH3)，0.70(3H，m，18-CH3)為甲基上的氫信號(hào)。13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ：140.8(C-5)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.8(C-14)，56.1(C-17)，50.1(C-9)，45.8(C-24)，42.3(C-4)，39.8(C-13)，37.3(C-12)，36.5(C-1)，36.2(C-10)，33.9(C-20)，33.7(C-7)，31.9(C-22)，31.7(C-8)，29.7(C-25)，29.2(C-16)，28.3(C-23)，26.1(C-2)，24.3(C-15)，23.1(C-28)，21.1(C-11)，19.8(C-27)，19.4(C-18)，19.0(C-29)，18.8(C-21)，11.9(C-26)，11.9(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為β-谷甾醇。

化合物2棕色油狀物;常溫下易溶于甲醇、醋酸乙酯、丙酮等。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：9.55(1H，s，H-5)，7.40(1H，d，J=3.6 Hz，H-2)，6.60(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，4.63(2H，s，H-6)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：179.4(CHO-)，163.2(C-5)，153.8(C-2)，124.7(C-3)，110.8(C-4)，57.6(CH2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為5-羥甲基糠醛。

化合物3白色針狀晶體;10% 硫酸-乙醇溶液顯棕黃色，Molish反應(yīng)呈陽性。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：3.83～3.54(7H，m，F(xiàn)ru-H)，3.42(2H，m，H-1)，1.47(2H，m，H-2)，1.31(2H，m，H-3)，0.84(3H，t，J=7.4 Hz，H-4)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：101.4(C-2′)，71.4(C-5′)，70.9(C-4′)，70.4(C-6′)，65.0(C-1′)，63.3(C-3′)，61.4(C-1)，33.1(C-2)，20.3(C-3)，14.1(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3鑒定為正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷。

化合物4透明膠狀物;Molish反應(yīng)呈陽性，1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.88(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，5.78(1H，s，H-4)，5.64(1H，dd，J=15.6，7.2 Hz，H-8)，4.44(1H，q，J=6.5 Hz，H-9)，4.18(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，3.76(1H，dd，J=11.9，2.0 Hz，H-6′ a)，3.55(1H，dd，J=11.9，6.2 Hz，H-6′b)，3.26～3.01(4H，m，H-3′，H-4′，H-2′，H-5″)，2.51(1H，d，J=17.0 Hz，H-2a)，2.09(1H，d，J=16.9 Hz，H-2b)，1.85(3H，s，H-13)，1.20(3H，d，J=6.5 Hz，H-10)，0.93(6H，d，J=12.7 Hz，H-11，12)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：199.9(C-3)，165.7(C-5)，132.3(C-7，8)，125.7(C-4)，99.8(C-1′)，78.6(C-6)，76.9(C-5′)，76.7(C-3′)，73.5(C-9)，73.2(C-2′)，70.2(C-4′)，61.4(C-6′)，49.3(C-2)，41.0(C-1)，23.3(C-12)，22.1(C-11)，20.9(C-10)，18.2(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，鑒定化合物4為(6S，9S)-長壽花糖苷。

化合物5白色粉末;1H NMR(800 MHz，CD3OD)δ：8.03(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=4.7 Hz，H-1′)，5.71(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，4.18(2H，m，H-3′，H-2′)，4.02(1H，m，H-4′ )，3.86(1H，dd，J=12.5，2.7 Hz，H-5′b)，3.75(1H，dd，J=12.2，3.1 Hz，H-5′b)；13C NMR(201 MHz，CD3OD)δ：166.3(C-4)，152.2(C-2)，142.4(C-6)，102.3(C-5)，90.4(C-1′)，86.0(C-4′)，75.4(C-3′)，71.0(C-2′)，62.3(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為尿嘧啶核苷。

化合物6白色晶體;溴甲酚綠反應(yīng)呈陽性。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：2.47(4H，s，-CH2)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：176.1(-COOH)，29.8(-CH2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為琥珀酸。

化合物7白色粉末;1H NMR(800 MHz，CD3OD)δ：3.69(3H，s，-OCH3)，2.61(4H，s，H-2，H-3)；13C NMR(201 MHz，CD3OD)δ：176.1(-COOH)，174.8(COO-)，52.2(-OCH3)，29.9(C-2，3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為琥珀酸甲酯。

化合物8淡黃色粉末;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.33(1H，d，J=15.8 Hz，H-7)， 7.26(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，H-6)，6.65(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，H-5)，6.24(1H，d，J=15.7 Hz，H-8)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：177.3(C-9)，159.9(C-4)，142.2(C-7)，130.1(C-2，6)，128.2(C-1)，121.8(C-8)，116.4(C-3，5)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[14]對(duì)照一致，故鑒定化合物8為對(duì)羥基肉桂酸。

化合物9白色粉末;10% 硫酸-乙醇顯色顯黃色斑點(diǎn)，Molish反應(yīng)呈陽性。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：4.29(1H，d，J=7.8 Hz)，1.25(3H，t，J=7.1 Hz，CH3)，3.97(1H，m)，3.68(1H，m)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：102.7(C-1′)，76.7(C-5′)，76.5(C-3′)，73.7(C-2′)，70.2(C-4′)，64.7(C-1)，61.3(C-6′)，14.0(C-2)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[15]對(duì)照一致，故鑒定化合物9為乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物10白色粉末;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：4.30(1H，dd，J=9.0，4.3 Hz，H-5)，4.19(2H，t，J=6.6 Hz，H-7)，2.58～2.46(1H，m，H-4a)，2.44～2.29(2H，m，H-3)，2.17(1H，m，H-4b)，1.74～1.63(2H，m，H-8)，1.43(2H，m，H-9)，0.98(3H，t，J=7.4 Hz，H-10)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：172.7(C-2)，64.9(C-7)，55.7(C-5)，30.3(C-8)，28.9(C-3)，24.5(C-4)，18.7(C-9)，12.6(C-10)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[16]對(duì)照一致，故鑒定化合物10為焦谷氨酸正丁酯。

化合物11白色粉末;碘熏顯色，與三氯化鐵試劑反應(yīng)呈陽性，說明該化合物結(jié)構(gòu)中含有酚羥基。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.90(2H，d，J=8.4 Hz，H-9，13)，6.61(2H，d，J=8.4 Hz，H-10，12)，4.14(1H，m，H-6)，3.56(1H，m，H-3)，3.10(1H，dd，J=13.9，3.5 Hz，H-7a)，2.74 (1H，dd，J=13.9，4.7 Hz，H-7b)，1.33(1H，m，H-15)，0.78(1H，m，H-14)，0.64(6H，m，H-16，17)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：170.6(C-2)，169.2(C-5)，158.1(C-11)，133.1(C-9，13)，127.2(C-8)，116.4(C-10，12)，57.7(C-6)，54.1(C-3)，45.2(C-14)，39.4(C-7)，24.8(C-15)，23.3(C-16)，21.3(C-17)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[17]對(duì)照一致，故鑒定化合物11為環(huán)(酪氨酸-亮氨酸)二肽。

化合物12白色粉末;碘熏顯色。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：4.22～4.00(2H，m)，3.68(1H，m)，3.40(2H，m)，2.21(1H，m)，1.77～1.95(2H，m)，1.54(1H，m)，1.43(1H，m)，1.32(1H，m)，0.86(6H，m)；13C NMR(151 MHz，CD3OD)δ：171.4(C-4)，167.5(C-2)，58.8(C-3)，53.2(C-1)，45.0(C-7)，37.9(C-8)，27.6(C-5)，24.3(C-6)，22.2(C-9)，21.8(C-10)，20.8(C-11)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[18]對(duì)照一致，故鑒定化合物12為環(huán)(L-脯氨酸-D-亮氨酸)。

化合物13白色無定型粉末;1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.28(26H，s，13 × CH2)，0.90(3H，t，J=7.0 Hz，CH3)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ：33.0(C-3)，31.5(C-4)，29.3(C-4～13)，22.8(C-2)，22.3(C-15)，18.0(C-1)，13.7(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[19]對(duì)照一致，故鑒定化合物13為氯代正十六烷。

化合物14白色粉末;碘熏顯色。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.35 (2H，t，J=4.8 Hz，H-9，10)，2.27～2.19 (2H，m，H-2)，2.01(2H，dd，J=12.6，6.7 Hz，H-8)，1.64(2H，dt，J=15.2，7.6 Hz，H-11)，1.30(22H，m，H-12～17，3～7)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H-18)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ172.5(C-1)，129.9(C-9，10)，36.0(C-2)，31.9(C-16)，29.7(C-4，5)，29.7(C-6)，29.6(C-7)，29.5(C-8)，29.5(C-11)，29.4(C-12)，29.3(C-13)，29.2(C-14)，27.2(C-15)，25.5(C-3)，22.6(C-17)，14.1(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[20]對(duì)照基本一致，故鑒定化合物14為油酸酰胺。

化合物15白色粉末;碘熏顯色。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.98(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.90～0.79(9H，m，H-29，26，27)，0.72(3H，s，H-18)；13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ：209.1(C-3)，209.0(C-6)，57.5(C-5)，56.6(C-14)，56.0(C-17)，53.5(C-9)，46.6(C-10，13)，45.8(C-7，24)，39.3(C-12)，38.1(C-1)，38.0(C-8)，37.4(C-2)，37.0(C-4)，36.0(C-20)，33.8(C-22)，29.7(C-25)，28.0(C-16)，26.0(C-23)，24.0(C-15)，23.0(C-28)，21.6(C-11，29)，19.8(C-26)，19.0(C-27)，18.7(C-21)，12.5(C-19)，12.0(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[21]對(duì)照基本一致，故鑒定化合物15為豆甾烷-3，6-二酮。

3.2 藥理活性篩選結(jié)果

MTT法測得該化合物在給藥濃度低于125 μM時(shí)，未表現(xiàn)出對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞明顯的抑制作用，給藥濃度為180 μM時(shí)對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的抑制率達(dá)50%。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從十字花科蕓薹屬植物大白菜中共分離得到15個(gè)化合物，有11個(gè)首次從蕓薹屬植物中分得，14個(gè)首次從大白菜中分得，豐富了大白菜化學(xué)成分的參考資料。據(jù)報(bào)道，正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(化合物3)具有誘導(dǎo)肝癌Bel-7402 細(xì)胞凋亡的作用,且隨著濃度的升高和作用時(shí)間的延長，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)，不同濃度的正丁基-β-D-吡喃果糖苷與Bel-7402細(xì)胞作用24、48 h可明顯抑制Bel-7402 細(xì)胞存活，25 mg/L的正丁基-β-D-吡喃果糖苷抑制率達(dá)到42.39%[22]。因分離所得的化合物3含量達(dá)500 mg，在正丁醇層中大量存在，且已有活性研究基礎(chǔ)，其余化合物因分離得到的數(shù)量少或未有文獻(xiàn)報(bào)道顯著活性，故只對(duì)化合物3進(jìn)行了體外藥理活性測試，結(jié)果表明給藥濃度低于125 μM時(shí)，該化合物對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的生長作用抑制不明顯，為大白菜的生物活性研究提供了參考依據(jù)。