β-乳球蛋白、葉酸和視黃醇三元復(fù)合物的形成機制及功能性質(zhì)

包小妹，鐘俊楨*，周若楠，周 磊，劉成梅

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛乳中主要的乳清蛋白，約占總?cè)榍宓鞍椎?0%[1-2]，是脂質(zhì)運載蛋白家族的成員之一，具有多個配體結(jié)合位點，能有效包埋、傳遞和保護生物活性成分使其免受氧化和降解[3]。有研究表明，β-LG可以增加兒茶素的抗氧化性，降低葉酸（folic acid，F(xiàn)A）的光損失[4]，提高姜黃素的溶解度[5-6]等。同時，β-LG與這些小分子結(jié)合后，在改善和保護小分子功能性質(zhì)的同時，β-LG自身的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)也會發(fā)生輕微改變[7-8]，Liang Li等[9]研究表明β-LG與FA的相互作用可以降低FA的光解；Abd El-Maksoud等[10]報道β-LG與咖啡酸的非共價結(jié)合，提高了β-LG的熱穩(wěn)定性和抗氧化性；趙煥焦等[11]提出β-LG與黑米花色苷的相互作用提高了它的抗氧化性。由此可以看出β-LG與小分子的相互作用是一個互利共贏的過程，β-LG可作為良好的生物活性載體提高保護小分子活性物質(zhì)溶解度和穩(wěn)定性。

目前β-LG作為綠色生物載體的研究多集中在與疏水性或兩親性小分子單配體復(fù)合物的形成和釋放及多個單配體結(jié)合位點的競爭等方面[12-13]。但在利用β-LG作為載體提高生物活性成分方面仍然存在一些問題：1）對于β-LG同時與親水性和疏水性的小分子多元復(fù)合物的形成機制不明確；2）β-LG-多配體復(fù)合物功能性質(zhì)尤其是致敏性的變化尚不清晰。

基于食品體系是一個較復(fù)雜的體系，可能同時存在β-LG和不同性質(zhì)的多種小分子活性物質(zhì)，研究β-LG與多個不同性質(zhì)的小分子多元復(fù)合物的形成機制、探究β-LG-小分子多元復(fù)合物的功能特性有助于提高β-LG作為生物載體的利用率，了解小分子與β-LG在食品中的真實狀態(tài)和它們之間的相互影響。因此，本實驗取對預(yù)防神經(jīng)管畸形具有協(xié)同功效的親水性FA和疏水性視黃醇（VA）與β-LG相互作用形成三元復(fù)合物，采用熒光光譜探究β-LG與不同性質(zhì)的小分子多元復(fù)合物的形成機制，并對蛋白質(zhì)的抗氧化性和致敏性進行表征，以期為提高β-LG作為生物載體的利用率及了解疏水性小分子和親水性小分子與β-LG的相互作用機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳β-LG、FA、VA 美國Sigma公司；所用水均為去離子水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；SynergyH1酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；Ultra-TurraxT25高速分散機 德國IKA公司；FiveEasy Plus pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-LG、FA和VA復(fù)合物的制備

參考Zhang Jie等[14]的方法稍加改進，通過將β-LG和FA分別溶解在pH 7.4、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中以獲得2 mmol/L的儲備溶液，在無水乙醇中制備終濃度為2 mmol/L的VA儲備溶液。通過將蛋白質(zhì)和FA或VA儲備溶液添加到PBS中制備β-LG-配體混合物（β-LG的最終濃度為10 μmol/L）。以1 h為間隔順序?qū)⑴潴w儲備溶液添加到β-LG溶液中制備含有多種配體的混合物。其中，不同名稱（例如β-LG-FA或β-LG-FA-VA）表示配體添加序列。室溫下，新鮮制備FA和VA溶液，樣品在離心管中制備并用鋁箔覆蓋，一式三份進行測試。

1.3.2 內(nèi)源熒光的測定

根據(jù)Liu Yan等[15]的方法，測定蛋白質(zhì)樣品的固有熒光光譜，測定10 μmol/L的β-LG溶液中存在不同濃度配體（1、2、5、10、15、20、50 μmol/L）時的熒光光譜。熒光光譜掃描在激發(fā)波長295 nm，波長掃描范圍290～450 nm，掃描頻率240 nm/min，狹縫寬度2.5 nm的條件下進行。以PBS溶液為空白對照。

1.3.3 近紫外圓二色（circular dichroism，CD）光譜分析

制備β-LG質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，采用MOS-450光譜偏振計在室溫下測量所有樣品的CD[16]。路徑長度為1 cm的圓柱形石英比色皿用于收集近紫外（250～300 nm）區(qū)域的數(shù)據(jù)。掃描條件：掃描速率100 nm/min，步長分辨率1 nm，帶寬2.0 nm。

1.3.4 抗氧化能力的表征

1.3.4.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhdrazyl，DPPH）自由基清除能力測定

結(jié)合文獻[17]并稍作修改。配制0.2 mmol/L的DPPH反應(yīng)液，渦旋混勻后，避光靜置30 min。取1.5 mL DPPH與0.5 mL樣品混勻后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長下測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計算：

式中：A1為樣品吸光度；A0為空白對照的吸光度。1.3.4.2 2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力測定

結(jié)合文獻[18]并稍加修改。ABTS陽離子自由基儲備液的制備：將10 mg的ABTS溶于2.6 mL的2.45 mmol/L的高硫酸鉀溶液中，在避光室溫條件下放置12～16 h。ABTS工作液的制備：使用前將ABTS儲備液用pH 7.4的PBS稀釋，使其在734 nm波長處測得的吸光度為0.700±0.020。取20 μL樣品與ABTS工作液混合，室溫下反應(yīng)60 min，在734 nm波長下測定吸光度，PBS作為空白對照。ABTS陽離子自由基清除能力按式（2）計算：

式中：A1為樣品吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.4.3 鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法

參考李明[19]方法稍作修改，將需要檢測的樣品與100 μL 1%的鐵氰化鉀混合均勻，50 ℃反應(yīng)20 min，然后加入100 μL 10%三氯乙酸，充分混勻，離心，取上清液100 μL，加入100 μL蒸餾水和20 μL 0.1%的FeCl3，室溫反應(yīng)10 min，在700 nm波長處測吸光度。FRAP值按式（3）計算：

式中：A1為樣品吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.5 致敏性的變化

根據(jù)Kleber等[20]建立的間接競爭性ELISA并進行一些修改，測量樣品的抗原性。使用天然β-LG溶液（2.5 μg/mL）包被9 6 孔微量滴定板，然后使用抗β-LG-IgY（稀釋比1∶35 000）和純化的山羊抗兔IgG∶HRP（稀釋比1∶20 000）用于測試樣品的抗原反應(yīng)。通過樣品致敏性的抑制率表示抗原抗體結(jié)合能力的強弱。在間接競爭ELISA實驗中，致敏性的抑制率以式（4）表示：

式中：B0為無競爭蛋白時的吸光度；B為各競爭蛋白（檢測樣品）對應(yīng)的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異顯著。所有實驗均重復(fù)3 組，采用Origin 8.5軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA和VA對β-LG熒光光譜的影響

圖1 不同濃度FA 和 VA 對 β-LG內(nèi)源熒光強度的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of FA and VA on intrinsic fluorescence intensity of β-LG

β-LG含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等熒光團[21]，β-LG與小分子之間的結(jié)合會改變熒光團的微環(huán)境，從而影響蛋白質(zhì)的熒光強度[22]，可用于表征β-LG與FA和VA之間的相互作用及檢測β-LG的構(gòu)象變化。由圖1A、B可知，在激發(fā)波長為295 nm時，隨著β-LG溶液中FA或VA濃度的逐漸增大，β-LG的內(nèi)源熒光強度均逐漸減小，證明β-LG分別與FA和VA發(fā)生了相互作用，改變了β-LG的構(gòu)象，使色氨酸和酪氨酸處于更加親水的環(huán)境中，疏水性下降[23]。

進一步探究FA對β-LG-VA熒光強度的影響以及VA對β-LG-FA熒光強度的影響，由圖1C、D同樣可觀察到隨著VA和FA濃度的逐漸增加，β-LG-FA和β-LG-VA的熒光強度均逐漸降低，表明在FA存在時，VA可以與β-LG發(fā)生相互結(jié)合，進一步影響β-LG的空間構(gòu)象；在VA存在時，F(xiàn)A同樣可以與β-LG發(fā)生相互結(jié)合，并進一步影響β-LG的空間構(gòu)象。這可能是因為FA和VA在β-LG上有不同的主要結(jié)合位點[24]。

圖2 不同F(xiàn)A和VA添加順序?qū)Ζ?LG熒光強度的猝滅曲線Fig. 2 Quenching curves of fluorescence intensity of β-LG with different addition orders of FA and VA

如圖2所示，VA對β-LG和β-LG-FA的熒光猝滅程度幾乎相同，這表明FA的存在對VA與β-LG的相互結(jié)合幾乎沒影響。但在β-LG-VA中添加不同濃度的FA時，F(xiàn)A對β-LG-VA熒光強度的猝滅程度弱于對β-LG的猝滅，即VA能減弱FA與β-LG的相互結(jié)合，這可能是因為FA在β-LG上只有一個結(jié)合位點，而VA在β-LG具有多個結(jié)合位點[24]。

2.2 熒光猝滅機制分析

小分子對蛋白質(zhì)的熒光猝滅一般可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[25]。靜態(tài)猝滅表現(xiàn)為隨著溫度的升高，復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，猝滅速率常數(shù)降低；而動態(tài)猝滅則相反，且不影響熒光分子的結(jié)構(gòu)[26]。本實驗在301 K和311 K下測定了不同濃度的FA和VA對β-LG熒光強度的影響。用Stern-Volmer方程[21]計算猝滅速率常數(shù)，從而可以初步判斷該反應(yīng)的熒光猝滅機理：

式中：F0為β-LG未加入FA和VA時的熒光強度；F為β-LG加入FA和VA的熒光強度；Kq為猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；Ksv為猝滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為FA/VA濃度/（mol/L）；τ0為無配體加入時蛋白質(zhì)的平均熒光壽命/s。一般認(rèn)為，10－8s為生物大分子的平均熒光壽命[8]。

如表1所示，隨著溫度的升高，β-LG復(fù)合物的猝滅速率常數(shù)Kq升高，表明FA和VA對β-LG的熒光猝滅可能是動態(tài)猝滅。但圖3表明β-LG-FA和β-LG-VA的Stern-Volmer曲線并不是線性關(guān)系，即FA和VA對β-LG的熒光猝滅并不是單純的動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅，而是2 種猝滅機制共存。β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA的Stern-Volmer曲線與β-LG-FA和β-LG-VA的Stern-Volmer曲線具有相似的變化趨勢，因此可以推測，在β-LG先與FA/VA相互作用后，再分別添加新的小分子配體VA/FA，同樣可以與β-LG發(fā)生相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，且同時存在2 種猝滅機制。

由表1可知，在301 K下，F(xiàn)A和VA分別對β-LG的猝滅速率常數(shù)Kq以及VA對β-LG-FA和FA對β-LG-VA的猝滅速率常數(shù)Kq分別為3.31×1012、6.40×1012、5.51×1012、3.25×1012L/（mol·s），遠大于動態(tài)淬滅速率常數(shù)（2×1010L/（mol·s）），即FA和VA對β-LG的熒光猝滅機制主要表現(xiàn)為靜態(tài)猝滅[26]，F(xiàn)A和VA與β-LG反應(yīng)形成二元和三元復(fù)合物。

表1 FA和VA與-LG的結(jié)合參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Binding parameters and thermodynamic parameters of-LG with FA and or VA

圖3 β-LG與FA和VA相互作用的Stern-Volmmeerr曲線Fig. 3 Stern-Volmer curves of β-LG interaction with FA and/or VA

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

由2.2節(jié)結(jié)果可知，F(xiàn)A和VA對β-LG的熒光猝滅主要是靜態(tài)猝滅，所以采用Double-log方程[27]計算結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點數(shù)n：

式中：Ka為FA和VA與β-LG之間的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為結(jié)合位點數(shù)，結(jié)果顯示在表1中。

由于Double-log曲線的R2都大于0.9，線性較好，所以FA/VA對β-LG、VA對β-LG-FA以及FA對β-LG-VA的熒光猝滅主要為靜態(tài)猝滅是合理的。由表1可知，在301 K的條件下，β-LG對FA和β-LG對VA的Ka和n分別為1.93×104L/mol、1.10和1.79×104L/mol、1.35，結(jié)合常數(shù)（Ka）的數(shù)量級為104，遠大于100[28]，結(jié)合位點數(shù)n都在1附近，即一分子的β-L G可以與一分子不同親疏水性的FA和VA形成較穩(wěn)定的β-LG-FA和β-LG-VA二元復(fù)合物；β-LG-FA對VA以及β-LG-VA對FA的Ka和n分別為1.78×104L/mol、1.22和1.24×104L/mol、1.23，由此可知，β-LG可以與一分子的FA和VA形成較穩(wěn)定的不同添加順序的三元復(fù)合物β-LGFA-VA和β-LG-VA-FA。通過比較Ka可知，VA的存在會使FA與β-LG的結(jié)合減弱，而FA的存在不會降低VA與β-LG的結(jié)合，與2.1節(jié)不同添加順序?qū)Ζ?LG熒光強度的猝滅結(jié)果一致。但由于不同的結(jié)合順序?qū)Ζ?LG結(jié)構(gòu)和功能的具體影響暫不清楚，因此以β-LG與FA和VA的物質(zhì)的量比為1進行制樣，同時制備不同添加順序的三元復(fù)合物。

2.4 熱力學(xué)參數(shù)

小分子配體與蛋白質(zhì)之間的非共價相互作用力主要有氫鍵、范德華力、疏水作用力及靜電引力[29]。可以根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)焓變值（ΔH）和熵變值（ΔS）判斷蛋白質(zhì)-配體之間的非共價相互作用力，這些熱力學(xué)參數(shù)可以通過Van't Hoff方程[30]計算得到：

式中：R為氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；T為實驗溫度/K；Ka為在相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）。

如表1所示，β-LG分別與FA和VA進行反應(yīng)時，ΔG＜0、ΔH＞0且ΔS＞0，表明β-LG與FA和VA主要通過疏水相互作用力自發(fā)的形成二元復(fù)合物β-LG-FA和β-LG-VA[25]。進一步探究VA與β-LG-FA和FA與β-LG-VA的相互作用，同樣可得ΔG＜0、ΔH＞0且ΔS＞0，因此β-LG與不同添加順序的FA和VA也是主要通過疏水相互作用力自發(fā)的形成三元復(fù)合物β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA。這也與前人關(guān)于β-LG主要通過疏水相互作用與小分子配體形成復(fù)合物的報道相吻合[31-32]。

2.5 近紫外CD分析

使用近紫外CD進一步評估樣品在溶液中的三級結(jié)構(gòu)，可以反映蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、二硫鍵等殘基的微觀結(jié)構(gòu)[33]，如圖4所示。與對照β-LG相比，β-LG-FA的摩爾橢圓率急劇上升，β-LG-VA的摩爾橢圓率急劇下降，特別是280 nm到295 nm波長之間的橢圓率，反映了色氨酸和酪氨酸的特征譜峰，表明FA和VA與β-LG的結(jié)合導(dǎo)致色氨酸和酪氨酸微環(huán)境發(fā)生較大的改變，三級結(jié)構(gòu)變化明顯，F(xiàn)A和VA與β-LG形成二元復(fù)合物后對β-LG原有的三級結(jié)構(gòu)改變較大。而β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA的摩爾橢圓率與β-LG相比僅略微改變，這可能是VA進一步影響β-LG-FA的構(gòu)象、FA進一步影響β-LG-VA的構(gòu)象，反而使其三級結(jié)構(gòu)更接近β-LG的三級結(jié)構(gòu)。

圖4 近紫外CCDD圖Fig. 4 Near-UV CD spectra

2.6 FA和VA對β-LG抗氧化性的影響

有研究表明β-LG與小分子配體的相互作用可以改變β-LG的功能特性，降低或提高β-LG的抗氧化性[4,12-13]，因此本研究采用3 種不同原理的檢測方法綜合評價FA和VA對β-LG抗氧化性的影響，結(jié)果如圖5所示。通過DPPH法測定的結(jié)果可以看出，β-LG與二元復(fù)合物β-LG-FA和β-LG-VA的自由基清除率分別為4.00%、1.98%和3.48%，沒有顯著性差異。進一步比較β-LG與三元復(fù)合物β-LGFA-VA（5.35%）和β-LG-VA-FA（3.64%）的DPPH自由基清除率，也不存在顯著性差異，但三元復(fù)合物β-LGFA-VA的抗氧化性顯著高于二元化合物β-LG-FA；通過ABTS法測定的結(jié)果可以看出，相對于β-LG的自由基清除率（22.2 2%）而言，二元復(fù)合物β-LG-FA的自由基清除率下降為20.91%，結(jié)合近紫外CD的結(jié)果可知，這可能與β-LG-FA的構(gòu)象中色氨酸和酪氨酸處于更加親水的環(huán)境有關(guān)[16,33]，β-LG-VA的自由基清除率（22.75%）沒有顯著變化。三元復(fù)合物β-LG-FA-VA（23.45%）和β-LG-VA-FA（23.71%）的自由基清 除率顯著高于對照組和二元復(fù)合物，但β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA之間沒有顯著差異，由此可知，不同的結(jié)合順序?qū)?fù)合物的抗氧化性沒有顯著的影響；FRAP法測定的結(jié)果表明，相對于β-LG的FRAP（5.26%），β-LG-FA和β-LG-VA的F RAP分別為7.69%和2.7%，沒有發(fā)生顯著的變化。同樣與對照組相比，三元復(fù)合物β-LG-FA-VA（4.37%）和β-LG-VA-FA（3.56%）的FRAP沒有顯著性差異，不同的結(jié)合順序?qū)?fù)合物的抗氧化性沒有顯著影響，但β-LG-FA的FRAP顯著大于三元復(fù)合物。

圖5 FFAA/VVAA對β-LG抗氧化能力的影響Fig. 5 Effect of complexation with FA and/or VA on the antioxidant capacity of β-LG

DPPH和ABTS法測定結(jié)果表明β-LG-FA具有較低的自由基清除能力，但FRAP的結(jié)果卻表現(xiàn)出了較強的還原能力，可能是因為自由基清除能力的檢測原理不同于FRAP的原因。FA主要結(jié)合在β-LG的α-螺旋和β-桶型結(jié)構(gòu)間表面疏水帶[31]，改變了游離—SH所處的微環(huán)境，β-LG的FRAP主要由存在于β-LG表面的—SH貢獻[34]，且β-LG-FA的構(gòu)象變化較大，因此表現(xiàn)出了較強的抗氧化性。

雖然每種檢測方法所采用的原理不同，結(jié)果之間也會存在差異，但總體而言，二元復(fù)合物β-LG-FA的自由基清除能力會有所下降，β-LG-VA則不會發(fā)生顯著的變化，三元復(fù)合物β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA的抗氧化能力并不會降低，且不同的結(jié)合順序?qū)?fù)合物的抗氧化性沒有顯著的影響?？梢酝茰yβ-LG-多配體復(fù)合物的功能性質(zhì)更穩(wěn)定，可以更好地應(yīng)用于奶粉等功能性奶制品中。

2.7 FA和VA對β-LG致敏性的影響

當(dāng)競爭抗原的抑制率越大，則說明競爭抗原與抗體的結(jié)合能力越強，樣品的致敏性越強。如圖6所示，β-LG與FA和VA的相互作用改變了β-LG的致敏性，與β-LG的抑制率（63.06%）相比，二元復(fù)合物β-LG-VA輕微下降為56.12%，β-LG-FA（59.91%）則沒有發(fā)生顯著變化。但三元復(fù)合物β-LG-VA-FA的抑制率升高為70.32%，β-LGFA-VA的抑制率下降為42.23%。β-LG的過敏性主要是由過敏表位決定，包括線性表位和構(gòu)象表位。當(dāng)構(gòu)象發(fā)生變化時，會改變它的過敏表位，從而影響其過敏性[35]。β-LG與VA在形成二元復(fù)合物的過程中，改變了β-LG的構(gòu)象，掩蓋了部分構(gòu)象表位，導(dǎo)致β-LG-VA的致敏性輕微下降[36-37]。β-LG與FA在形成二元復(fù)合物的過程中，對照近紫外CD光譜的分析可知，對β-LG的構(gòu)象影響雖大，但不同于β-LG-VA的構(gòu)象變化，可能對β-LG的構(gòu)象表位影響較小[31]，因此β-LG-FA的致敏性與β-LG的致敏性沒有顯著差異。當(dāng)在二元復(fù)合物β-LG-FA和β-LG-VA中再添加VA/FA形成三元復(fù)合物β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA時，β-LG的構(gòu)象進一步發(fā)生改變。β-LG-VA-FA的致敏性升高可能是因為VA先與β-LG結(jié)合[25-26]形成二元復(fù)合物時，改變了β-LG的構(gòu)象，掩蓋了部分構(gòu)象表位，當(dāng)FA再結(jié)合在β-LG表面時[31]，由于結(jié)合位點的競爭，可能會重新暴露或產(chǎn)生新的過敏表位。然而β-LG-FA-VA的致敏性下降，可能是FA只結(jié)合在β-LG的表面，對β-LG構(gòu)象的影響輕微，當(dāng)VA加入在β-LG-FA中時，由于VA在β-LG上不是單一的結(jié)合位點，結(jié)合過程會使β-LG的構(gòu)象表位被進一步掩蓋。由此可知β-LG與小分子配體結(jié)合時，不同的結(jié)合順序不僅會影響結(jié)合能力，也會影響蛋白質(zhì)的致敏性。且多個配體的影響作用大于單一配體。

圖6 FFAA/VVAA對β-LG抗原性的影響Fig. 6 Effect of complexation with FA and/or VA on the antigenicity of β-LG

3 結(jié) 論

本研究利用熒光光譜表征FA和VA與β-LG多元復(fù)合物的形成及相互作用機制，結(jié)果表明親水性的FA和疏水性的VA對β-LG具有較強的熒光猝滅，且存在動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅2 種猝滅機制，通過計算猝滅速率常數(shù)（Kq）可知主要為靜態(tài)猝滅，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)表明FA和VA可以與β-LG自發(fā)的通過疏水相互作用形成結(jié)合常數(shù)（Ka）大于104L/mol，物質(zhì)的量比約為1的較穩(wěn)定的二元復(fù)合物β-LG-VA和β-LG-FA以及三元復(fù)合物β-LGVA-FA和β-LG-FA-VA。通過比較FA和VA分別對β-LG-VA和β-LG-FA的熒光猝滅的程度可知，VA的存在會影響FA對β-LG的親和性，而FA的存在不會影響VA對β-LG的親和性。近紫外CD光譜表明，相較于β-LG，β-LG-FA和β-LG-VA的構(gòu)象變化較大，而β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA的構(gòu)象變化輕微。DPPH法和FRAP法測定的結(jié)果均表明不同結(jié)合順序的三元復(fù)合物β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA的抗氧化性與β-LG的抗氧化性之間沒有顯著差異。但ABTS和FRAP法測定的結(jié)果表明FA單獨與β-LG的相互作用會改變蛋白質(zhì)的抗氧化性，而β-LG-VA與對照組間沒有顯著差異。ABTS法表明三元復(fù)合物β-LG-FA-VA和β-LG-VA-FA的抗氧化性顯著高于對照組，不同的結(jié)合順序?qū)?fù)合物的抗氧化性也沒有顯著影響，這與抗氧化性的測定原理不同有一定的關(guān)系。間接競爭ELISA表明β-LG-FA-VA致敏性抑制率降低為42.23%，β-LG-VA-FA的致敏性抑制率反而升高至70.32%，即不同的結(jié)合順序會對β-LG的致敏性產(chǎn)生不同程度的影響。結(jié)合近紫外CD光譜分析可知，三元復(fù)合物相對于二元復(fù)合物而言，β-LG的構(gòu)象會產(chǎn)生更復(fù)雜的多次變化，從而表現(xiàn)出二元復(fù)合物和β-LG所不能表現(xiàn)的性質(zhì)。