氣相色譜-負化學源-串聯(lián)質譜法測定動物源食品中氟蟲腈及其4種代謝產物殘留量

韓 超，胡貝貞，金 娜，劉 濱，沈 燕，金建昌，陳樹兵*

（1.浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310015；2.紹興海關綜合技術服務中心，浙江 紹興 312000；3.溫州海關綜合技術服務中心，浙江 溫州 325027；4.寧波海關技術中心，浙江 寧波 315040）

氟蟲腈是世界上首個苯基吡唑類殺蟲劑，也是一種廣譜殺蟲劑，能夠有效殺死跳蚤、虱子等生物[1-2]。世界衛(wèi)生組織表示，人類食用含有一定濃度的氟蟲腈食品，會損傷腎臟和肝臟，因而被世界衛(wèi)生組織列為“對人類有中度毒性”的化學品[3]。另外，氟蟲腈化學性質較為活潑，在環(huán)境中經水解和光解作用，能夠產生代謝產物氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈硫醚，代謝產物的毒性遠高于母體氟蟲腈。美國對雞蛋中的氟蟲腈的限量要求為0.02 mg/kg，歐盟規(guī)定氟蟲腈不得用于人類食品產業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過程，對所有食品的限量要求均為0.005 mg/kg。GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》，規(guī)定了氟蟲腈及代謝產物氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈硫醚之和在禽肉、禽蛋、禽內臟的限量要求分別為0.01、0.02、0.02 mg/kg。酰胺氟蟲腈盡管未被GB 2763—2019列入監(jiān)控范圍，國外已有報道在秋葵及蜂蜜和花粉中將酰胺氟蟲腈作為氟蟲腈代謝產物進行檢測[4-5]。

目前國內外對氟蟲腈及其代謝產物的測定主要有氣相色譜法[6-9]、氣相色譜-質譜法[10-12]、氣相色譜-串聯(lián)質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）法[13-14]、液相色譜法[15]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[16-21]和免疫分析法[20-23]。由于含有多個鹵原子，氟蟲腈及其代謝物的電負性極強，適用于負化學源（negative chemical ionization，NCI）測定，同時樣品溶劑和儀器本底中氧、硫等雜原子響應值低，由此提高了信噪比，目前已有文獻報道采用GC-NCI-MS/MS對氟蟲腈及其代謝產物的測定[24-25]。GC-MS/MS法多反應監(jiān)測（multireaction monitoring，MRM）模式實現(xiàn)了在復雜基質背景下對目標物的準確測定。有關動物源食品（禽肉、禽蛋、禽內臟）中氟蟲腈及其4 種代謝產物（氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚、酰胺氟蟲腈）殘留的GC-NCI-MS/MS同時測定鮮見報道。QuEChERS由于其具有簡便、快速、環(huán)境友好、試劑消耗少等優(yōu)點，在食品農、獸藥殘留分析中得到了廣泛的應用[26-27]。本研究采用QuEChERS法結合GC-NCI-MS/MS同時測定動物源食品（雞蛋、雞肉、雞肝）中氟蟲腈及其4 種代謝產物（氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚、酰胺氟蟲腈）殘留量，該方法靈敏度高、選擇性好，能夠滿足動物源食品中氟蟲腈及其4 種代謝產物殘留量的確證和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、雞肉、雞肝市購。

氟蟲腈標準品（CAS 120068-37-3，純度97.5%）、酰胺氟蟲腈（CAS205060-69-7，純度97.5%）、氟甲腈（CAS205060-65-3，純度98.0%）、氟蟲腈砜（CAS120068-36-2，純度98.5%）、氟蟲腈硫醚（CAS 120067-83-6，純度98.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；各個化合物結構見圖1。

圖1 氟蟲腈及4 種代謝物的化學結構式Fig. 1 Chemical structures of fipronil and four metabolites

乙腈、正己烷（均為色譜純） 德國Merck公司；鹽析包（含4 g硫酸鎂、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸鈉半水合物、1 g氯化鈉）和凈化管（含150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C18） 月旭科技（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Trace 1300-TSQ 8000三重四極桿GC-MS聯(lián)用儀（配有NCI）、ST16 R離心機 美國Thermo公司；GM 200組織搗碎機 德國萊馳公司；MS 105DU電子天平、PL 203電子天平 美國梅特勒-托利多公司；T18型均質器德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

取有代表性樣品500 g，將其切碎后，用組織搗碎機將樣品加工成漿狀，混勻，裝入潔凈的盛樣容器內，密封并標明標記。稱10 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（正己烷飽和），15 000 r/min高速均質2 min后加入鹽析包，劇烈振搖2 min，10 000 r/min高速離心5 min，取1 mL乙腈層提取物于10 mL離心管中，加入1 mL正己烷（乙腈飽和）渦旋混勻，靜置分層，棄去正己烷層，加入1 mL正己烷重復一遍。取乙腈層加入到2 mL凈化管中，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min高速離心5 min，取上清液供GC-NCI-MS/MS測定。

1.3.2 標準溶液配制

分別稱取每種適量標準品，用乙腈制得100 μg/mL標準儲備液。按1.3.1節(jié)方法制備不含待測組分的空白基質溶液，配制質量濃度分別為1、2、5、20、50、100 μg/L的系列基質標準工作溶液。

1.3.3 GC條件

HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初溫60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至200 ℃，再以15 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。進樣口溫度240 ℃，不分流進樣，進樣量1 μL，載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速1.0 mL/min。

1.3.4 MS條件

電離模式：NCI，反應氣為甲烷（純度≥99.99%）；電離能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度250 ℃；MRM模式，具體條件見表1。

表1 目標物的MRM分析條件Table 1 MRM MS conditions for target compounds

2 結果與分析

2.1 質譜參數(shù)的優(yōu)化

由于氟蟲腈及其4 種代謝產物分子結構中（圖1）都含有6 個氟原子、2 個氯原子，具有較強的電負性，在離子源內容易形成負離子。NCI屬于軟電離技術，具有較低噪聲背景的巨大優(yōu)勢，因此選用對含電負性基團有特異響應的NCI技術進行測定是最好的選擇[28]。采用NCI源在SCAN模式下，對5.0 mg/L的氟蟲腈及其4 種代謝產物分別進行一級質譜全掃描分析，得到每個目標物的母離子。在不同碰撞能量下，對目標物的母離子分別進行二級質譜掃描，得到每個母離子的碎片離子，選擇豐度較高的3～4 個子離子，配制不同種類的空白樣品基質標準溶液，在MRM模式下優(yōu)化各種質譜條件，剔除易受雜質干擾，選擇豐度最高的2 個子離子作為定量離子和定性離子，優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表1。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

雞蛋、雞肉和雞肝等動物源樣品含有的一定量脂肪和蛋白質。本實驗采用乙腈提取、高速離心，可以去除蛋白質的影響。對所含的脂肪，需對QuEChERS提取和凈化進行改進，采用3 個步驟去除脂肪：第1步樣品提取的時候采用正己烷飽和的乙腈，以減少脂肪溶解在乙腈中；第2步采用乙腈飽和的正己烷液液分配2 次去除脂肪，第3步凈化管中含有C18粉，可用于進一步去除脂肪。由于本實驗采用GC-MS/MS的NCI源和MRM模式，具有高選擇性和靈敏度，在此模式下得到的空白雞蛋樣品基質標準溶液的總離子流色譜圖中目標物出峰處無雜質干擾（圖2）。

圖2 空白雞蛋基質標準溶液（2200 μgg/L）的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of mixed standard solution(20 μg/L) with blank egg matrix

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系與定量限

采用基質匹配工作曲線以最大消除基體效應對定量結果的影響。采用外標法對1.3.2節(jié)制備的1、2、5、20、50、100 μg/L系列基質標準工作溶液進行上機測定，以各組分的定量離子的峰面積為縱坐標（Y），其質量濃度為橫坐標（X，μg/L）繪制標準曲線。結果表明，在1、2、5、20、50、100 μg/L質量濃度范圍內，各個化合物線性關系良好，線性方程和相關系數(shù)（r2）見表2。定量限采用在空白樣品中逐級降低加標濃度的方法確定，得到氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈硫醚的定量限（RSN≥10）為0.5 μg/kg，氟蟲腈砜、酰胺氟蟲腈的定量限（RSN≥10）為1.0 μg/kg。

表2 線性方程和相關系數(shù)Table 2 Linear equations with correlation coef ficients

2.3.2 回收率與精密度

在不同動物源食品的空白樣品中，分別進行2.0、10.0、20.0 μg/kg三個不同質量濃度水平的加標回收實驗，每個水平重復測定6 次，結果見表3，回收率在80.2%～108.7%之間，相對標準偏差為3.8%～10.2%，說明該方法的準確度和精密度良好。代表性的空白雞肉樣品加標MRM色譜圖見圖3。

表3 加標回收率和相對標準偏差結果Table 3 Results of spiked recoveries and RSDs

圖3 空白雞肉樣品加標（2..0 μg/kg）MRRMM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of spiked blank chicken meat samples(2.0 μg/kg)

2.4 實際樣品檢測結果

在農貿市場和超市購買不同的動物源食品，雞蛋、雞肉、雞肝，每種樣品各15 份，采用本方法進行檢測，結果顯示，有1 個雞蛋樣品中檢出氟蟲腈砜代謝藥物殘留，檢出值為5.2 μg/kg（圖4），沒有超過GB 2763—2019限量要求。

圖4 氟蟲腈砜陽性雞蛋樣品的定量離子MRM色譜圖Fig. 4 MRM chromatogram of a positive egg sample with fipronil sulfone

3 結 論

采用QuEChERS法提取和凈化，建立動物源食品中氟蟲腈及其4 種代謝產物（氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚、酰胺氟蟲腈）殘留量的GC-NCI-MS/MS測定方法。本研究在涵蓋GB 2763—2019規(guī)定的禽蛋、禽肉、禽內臟中氟蟲腈及氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚代謝物基礎上，增加了酰胺氟蟲腈的檢測，通過選擇NCI源和MRM模式，降低基體干擾，方法靈敏度高、準確性好，能夠滿足動物源食品中氟蟲腈及其代謝產物殘留量的確證和定量分析。