QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)魚(yú)腥草中121種農(nóng)藥殘留

茍 琰，高 馳，鄧晶晶，耿 昭*，袁 軍，李 敏,*，周 娟，郭 力，包曉明

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理 局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 61173 1；3.島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，四川 成都 610023）

魚(yú)腥草又名折耳根、豬鼻拱、紫蕺、臭菜等，在我國(guó)有廣泛分布。原植物為三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordataThunb.）[1]，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功效，現(xiàn)代研究證明其具有較好的抗炎活性[2-3]。作為藥食兩用植物，魚(yú)腥草在我國(guó)有著悠久的食用歷史[4]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，成分含量豐富，不僅可以作為蔬菜食用，還常被作為茶飲品[5]，深受云、貴、川、渝、湘等地老百姓喜愛(ài)，并廣泛出口至日、韓等國(guó)[6-7]。據(jù)產(chǎn)出效益統(tǒng)計(jì)，其食用產(chǎn)出值已經(jīng)是藥用產(chǎn)出的數(shù)倍[8-9]，有十分廣闊的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。隨著市場(chǎng)需求的不斷增大，全國(guó)各產(chǎn)區(qū)均大力研發(fā)栽培品種及技術(shù)[10]。然而，在大面積生產(chǎn)種植過(guò)程中，對(duì)于病蟲(chóng)害[11]的防治不乏要使用到各種農(nóng)藥[12]，在當(dāng)前倡導(dǎo)有機(jī)、綠色的食品環(huán)境下，控制魚(yú)腥草中農(nóng)藥殘留是不容忽視的問(wèn)題，同時(shí)農(nóng)藥的不合理使用也存在著一定的安全風(fēng)險(xiǎn)[13]。近年來(lái)，關(guān)于魚(yú)腥草中農(nóng)藥殘留檢測(cè)研究有一定報(bào)道[14-15]，但綜合考量，其所涉及到的農(nóng)藥種類(lèi)較少，缺乏較為系統(tǒng)的研究和數(shù)據(jù)，難以滿(mǎn)足當(dāng)前不斷提高的檢驗(yàn)檢測(cè)要求。農(nóng)藥多殘留檢測(cè)[16-19]目前獲得了廣泛的關(guān)注，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[20-23]是目前最為重要的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法，具有高靈敏度、專(zhuān)屬性強(qiáng)、定性定量同時(shí)進(jìn)行、高通量等優(yōu)點(diǎn)。QuEChERS[24-25]（quick, easy, cheap, effective,rugged, and safe）是近年來(lái)國(guó)際上發(fā)展起來(lái)的一種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，最先應(yīng)用于蔬菜水果中，其簡(jiǎn)單有效、安全快速的特點(diǎn)非常適合于基質(zhì)復(fù)雜的樣品前處理[26-28]。魚(yú)腥草含有揮發(fā)性成分、黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)等多種成分[29]，基底較為復(fù)雜。本研究采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）技術(shù)結(jié)合QuEChERS樣品前處理法建立快速篩查魚(yú)腥草中121 種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，并應(yīng)用于所收集到的大批量具有代表性的魚(yú)腥草樣品，旨在為魚(yú)腥草的規(guī)范化種植生產(chǎn)和市場(chǎng)安全監(jiān)管提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品來(lái)源均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)和產(chǎn)地采集，涵蓋野生和種植基地樣品，共68 批，分別來(lái)自四川、貴州、福建、云南、湖北等全國(guó)主要產(chǎn)區(qū)。

WondaPak QuEChERS乙酸鈉提取包、WondaPak QuEChERS 15 mL C18/PSA/GC-e/硅膠凈化管 美國(guó)Agilent公司；乙腈、丙酮（均為色譜純） 美國(guó)Fisher Chemical公司；乙酸（分析純） 成都科龍化工試劑廠；農(nóng)藥對(duì)照品溶液（100～1 000 μg/mL）、農(nóng)藥對(duì)照品（純度＞95%） 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司、美國(guó)AccuStandard Inc公司、農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所、北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ8040 GC-MS/MS聯(lián)用儀 日本Shimadzu公司；Millipore Q超純水器 美國(guó)Millipore公司；MS3 digital渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司；3-30k離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液及工作溶液的配制

溶液型對(duì)照品，質(zhì)量濃度為100～1 000 μg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液；固體對(duì)照品，精密稱(chēng)取適量，用乙腈溶解，配制成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。均于－40 ℃保存。

在配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)，充分考慮到每個(gè)化合物的響應(yīng)情況，最終配制質(zhì)量濃度各有不同：分別移取適量的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用丙酮配制成40～5 000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

樣品用打粉機(jī)粉碎，過(guò)三號(hào)篩孔徑（355±13）μm，稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g），至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入1%乙酸溶液15 mL，渦旋30 s，使藥粉充分浸潤(rùn)，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，置渦旋振蕩器上劇烈振蕩（3 000 r/min）5 min，－40 ℃放置20 min，加入無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉的混合粉末（質(zhì)量比4∶1）7.5 g，立即搖散，再置渦旋振蕩器上3 000 r/min劇烈振蕩5 min，然后5 000 r/min離心5 min后待凈化。

1.3.2.2 樣品凈化

取上清液8 mL，轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有900 mg無(wú)水硫酸鎂、300 mgN-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、300 mg十八烷基硅烷鍵合硅膠、300 mg硅膠、90 mg石墨化碳黑的離心管中，蓋緊離心管，渦旋5 min使凈化完全，5 000 r/min離心5 min。

1.3.2.3 濃縮及溶劑替換

精密量取上清液3 mL，40 ℃氮吹至近干，用丙酮定容至2 mL，離心，取上清液上機(jī)分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：60 ℃保持1 min，以30 ℃/min升至120 ℃，以10 ℃/min升至160 ℃，以2 ℃/min升至230 ℃，以15 ℃/min升至300 ℃，保持6 min，最后以20 ℃/min升至320 ℃，保持10 min；進(jìn)樣量1 μL，不分流；柱流速為線(xiàn)速度控制模式，初始流速1.3 mL/min；進(jìn)樣口溫度240 ℃。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；碰撞氣為氦氣；溶劑延遲時(shí)間5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)島津Labsolution軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件確定

選擇對(duì)中低極性化合物分離較好的毛細(xì)管柱色譜柱DB-17MS，通過(guò)SCAN模式掃描，確定農(nóng)藥的保留時(shí)間，通過(guò)對(duì)定性定量離子的確定及碰撞電壓的優(yōu)化后，建立MRM模式方法，每種農(nóng)藥選擇1 對(duì)定量離子，2 對(duì)定性離子，按照保留時(shí)間順序分段檢測(cè)。每種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子、定性離子見(jiàn)表1。農(nóng)藥混合對(duì)照品總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 121 種農(nóng)藥混合對(duì)照品MRM總離子流圖Fig. 1 MRM total ion chromatograms of mixed standard solution of 121 pesticides

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

乙腈作為QuEChERS法中最為常用的提取溶劑，適用于提取極性范圍較寬的多種農(nóng)藥，對(duì)水果蔬菜等含水量較高的樣品即可直接提取，但對(duì)于含水量較低的樣品，如果直接加乙腈進(jìn)行提取，其提取效率往往不高。此次收集到的魚(yú)腥草樣品即是如此，故在提取前加入水浸泡，促使樣品溶脹，以提高提取效率。另外考慮到QuEChERS提取包最佳使用環(huán)境為弱酸性，在水中加入1%乙酸溶液調(diào)整其pH值。

樣品經(jīng)乙腈提取后，如果直接加萃取鹽包，會(huì)立即劇烈放熱，不利于待測(cè)成分的檢測(cè)，考察在加萃取鹽包前放置在冰浴中20 min和直接放入冰箱冷凍室20 min，表明冰浴中放置的樣品在加入鹽包后仍會(huì)有較高的溫度，而冰箱冷凍放置則可顯著改善此情況。

魚(yú)腥草其主要成分包括黃酮類(lèi)、苷類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)成分，其全草均可食用，葉部分色素含量較高，在農(nóng)殘檢測(cè)中，此類(lèi)成分所帶來(lái)的基質(zhì)對(duì)于農(nóng)藥檢測(cè)的干擾非常大；另外，由于大多數(shù)待測(cè)目標(biāo)物均屬于中低極性化合物，而魚(yú)腥草中的揮發(fā)油類(lèi)成分極性也較低，同樣會(huì)帶來(lái)一定程度的基質(zhì)干擾，因此凈化除雜步驟尤為重要。本課題組結(jié)合前期的大量基礎(chǔ)工作[30]，將目前常用的樣品前處理方法分為3 種，第1種是基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物不存在太大干擾的品種，可以在充分保證準(zhǔn)確性的情況下，采用乙腈直接提取不凈化的方式進(jìn)行前處理；第2種和第3種方法為對(duì)于存在較大干擾需要進(jìn)行凈化的基質(zhì)，在乙腈提取后，分別采用QuEChERS和SPE小柱進(jìn)行凈化，QuEChERS凈化填料包括一定比例的PSA、石墨化碳、C18、硅膠及無(wú)水硫酸鎂；SPE方法包括石墨化碳柱、HLB柱、弗羅里硅土及氨基柱等。由于QuEChERS為復(fù)合凈化包，對(duì)雜質(zhì)的凈化優(yōu)于單一凈化填料，另外QuEChERS操作較為簡(jiǎn)單，更能保證結(jié)果的穩(wěn)定性，綜合考慮后，選用QuEChERS進(jìn)行凈化，另外除考察1.3.2.2節(jié)中凈化方法，同時(shí)也采用專(zhuān)門(mén)針對(duì)脂質(zhì)成分的EMRLipid dSPE（增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管（Agilent公司））進(jìn)行凈化效果篩選。結(jié)果，2 種方法從對(duì)基質(zhì)的干擾情況看，無(wú)明顯差異（圖2、3），而EMR-Lipid dSPE方法操作較為繁瑣，步驟更多，可能更易出現(xiàn)待測(cè)目標(biāo)物損失的情況（圖4），故采取1.3.2節(jié)所述方法。

圖2 滅線(xiàn)磷母離子及其子離子色譜圖Fig. 2 Chromatograms of precursor and product ions of ethoprophos with sample clean-up by QuEChERS or EMR-Lipid dSPE

表1 121 種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)、保留時(shí)間、混標(biāo)質(zhì)量濃度、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓、相關(guān)系數(shù)（ r）、線(xiàn)性范圍、精密度、平均回收率、RSD及檢出限Table 1 Mass spectrometric parameters, retention times, mixed standard concentrations, monitoring ion pairs, collision energy, correlation coeffificients ( ),linear ranges, precision, average recoveries, RSDs and limits of detection of 121 pesticides

續(xù)表1

圖3 嘧霉胺母離子及其子離子色譜圖Fig. 3 Chromatograms of precursor and product ions of pyrimethanil with sample clean-up by QuEChERS or EMR-Lipid dSPE

圖4 丙環(huán)唑母離子及其子離子色譜圖Fig. 4 Chromatograms of precursor and product ions of propiconazole with sample clean-up by QuEChERS or EMR-Lipid dSPE

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系與檢出限

取空白基質(zhì)樣品3 g，按1.3.2節(jié)方法處理，在用凈化包進(jìn)行凈化后，精密量取上清液3 mL，置氮吹儀上于40 ℃水浴濃縮至近干，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（表1）2 000、1 000、500、250、125、50、25、10、5 μL，加丙酮定容至2 mL，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，即得系列基質(zhì)混合對(duì)照品溶液（分別作為ST1～ST9）。按1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)進(jìn)行測(cè)試，經(jīng)選擇離子定量掃描，以峰面積為縱坐標(biāo)、以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得各農(nóng)藥的線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。根據(jù)化合物響應(yīng)情況，分別以ST8和ST9進(jìn)行檢出限計(jì)算，以定量離子信噪比RSN=3為樣品檢出限。結(jié)果表明，121 種農(nóng)藥線(xiàn)性良好，檢出限絕大多數(shù)小于0.01 mg/kg（表1）。

2.3.2 精密度與回收率

取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)ST6，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各目標(biāo)物響應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（表1）。樣品稱(chēng)量后，分別精密加入混合對(duì)照品貯備液各0.05 mL（3 倍檢出限）、0.1 mL（6 倍檢出限）、0.25 mL（15 倍檢出限），樣品經(jīng)1.3.2節(jié)方法處理后，每濃度各重復(fù)3 次，共9 份，結(jié)果回收率在60%～140%范圍內(nèi)的農(nóng)藥數(shù)占總數(shù)的90.9%，86.8%的農(nóng)藥RSD小于15%（表1）。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

來(lái)自全國(guó)主要產(chǎn)區(qū)68 批樣品種共檢出27 種農(nóng)藥，結(jié)果表2。

表2 樣品檢出批次及檢出范圍Table 2 Detection rates and concentration ranges of 27 pesticides in 68 sample batches

表3 不同來(lái)源樣品檢出農(nóng)藥種類(lèi)Table 3 Number of pesticide detected in Houttuynia cordata Thunb.from different geographical regions

續(xù)表3

由表3可知，魚(yú)腥草中農(nóng)殘檢出率接近50%，野生和栽培、自采和購(gòu)買(mǎi)的樣品中都有檢出，檢出率相差不大，說(shuō)明使用農(nóng)藥是比較普遍的情況。29 批有檢出的樣品中，共檢出27 種農(nóng)藥，僅檢出1 種農(nóng)藥的批次為14 批，檢出2 種及以上農(nóng)藥的批次為15 批，有甚者1 批樣品檢出10余種農(nóng)藥，且殘留量均處于較高水平，說(shuō)明目前尚有不少魚(yú)腥草栽培種植中的農(nóng)藥使用仍處于較為混亂的狀態(tài)。

3 討論與結(jié)論

參考GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[31]及NY/T 2874—2015《農(nóng)藥每日允許攝入量》[32]，檢出的農(nóng)藥中，氯氰菊酯、毒死蜱、三唑醇、多效唑、氟氯氰菊酯屬于殘留量較高，甲氰菊酯、毒死蜱、腐霉利屬于檢出率較高，另外，如丙溴磷、五氯苯胺等屬于中等毒性農(nóng)藥，以上農(nóng)藥均值得關(guān)注。

農(nóng)藥殘留檢測(cè)屬于痕量檢測(cè)，魚(yú)腥草作為藥材和蔬菜主要食用部位為地上部分或全草，樣品基質(zhì)中色素和脂溶性成分在前處理過(guò)程中應(yīng)盡量除去，本研究在實(shí)際操作采用的QuEChERS法獲得比較滿(mǎn)意的效果，90.9%的農(nóng)藥回收率在60%～140%之間[33]，根據(jù)回收率添加水平分析，能較為準(zhǔn)確地定性和定量；對(duì)于可能由于化合物性質(zhì)或者基質(zhì)影響的原因造成回收率偏高或偏低的農(nóng)藥，此方法可作為篩查方法，如需要準(zhǔn)確定量，可以采用以回收率進(jìn)行折算的方式獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高，大幅提高了檢測(cè)通量。通過(guò)廣泛收集樣品的數(shù)據(jù)累積，對(duì)有檢出農(nóng)藥殘留品種進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為魚(yú)腥草中農(nóng)殘檢測(cè)和限量制定提供數(shù)據(jù)支持，以促進(jìn)其進(jìn)一步規(guī)范種植和減少安全風(fēng)險(xiǎn)。