不同類型肺結(jié)核患者血漿miR-155和SOCS1表達及臨床意義*

呂芳，王松巖，張麗英，尚少紅，羅燕青，曾憲升，唐丹丹**

(1.石景山醫(yī)院 急診科，北京 100043；2.石景山醫(yī)院 呼吸科，北京 100043；3.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 襄陽 441021)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分歧桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的一種慢性傳染性疾病，嚴(yán)重威脅人類的身心健康，關(guān)于肺結(jié)核的研究治療已經(jīng)引起了醫(yī)學(xué)界的高度重視[1]。微小RNA (microRNAs，miRNA)廣泛存在于真核細胞中，是高度保守的非編碼單鏈小RNA分子，與腫瘤、免疫性疾病及感染性疾病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。微小RNA-155 (microRNAs-155，miR-155)是miRNA的重要成員之一，可參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、病毒感染及造血等多種生理病理過程，有研究發(fā)現(xiàn)miR-155可能與肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[3]。細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物1(suppressor of cytokine singaling 1，SOCS1)是SOCS家族的一員，是由細胞產(chǎn)生的一類可阻斷多種細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可通過抑制JAK/STAT、酪氨酸激酶受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來阻斷相關(guān)因子所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能參與多種免疫反應(yīng)調(diào)控，在控制免疫細胞分化中起著重要的作用[4-5]。目前關(guān)于miR-155與SOCS1在肺結(jié)核中作用的研究較少，本研究通過檢測不同時期肺結(jié)核患者血漿中miR-155和SOCS1的表達水平，分析二者與肺結(jié)核發(fā)病的關(guān)系，報告如下。

1 資料與方法

1.1對象及主要試劑與儀器

1.1.1研究對象 選取2017年10月—2018年10月收治的90例TB患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合“中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法定傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)”中肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)、并且確診為肺結(jié)核患者，(2)均接受抗結(jié)核治療，(3)年齡為20～80歲，(4)同意加入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并糖尿病、高血壓及自身免疫病等慢性疾病者，(2)合并心血管、腎臟、肝臟等器質(zhì)性疾病者，(3)合并HIV、HBV等人類免疫缺陷病毒感染疾病者，(4)近期使用免疫抑制劑類藥物或糖皮質(zhì)激素類藥物治療的患者，(5)結(jié)核病治療產(chǎn)生耐藥者。30例活動性肺結(jié)核患者作為活動性結(jié)核組、30例完成結(jié)核治療患者作為治療完成組，30例結(jié)核潛伏感染者為潛伏感染組，另選取同期健康體檢者40例作為對照組。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過，均取得入選者或家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》的規(guī)定。

1.1.2主要試劑與儀器 miRcute miRNA提取分離試劑盒(貨號DP501)，購自北京天根生化有限公司；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號KR201)，購自北京天根生化有限公司；熒光定量檢測試劑盒(貨號FP401)，購自北京天根生化有限公司；SOCS1因子ELISA試劑盒(貨號ml023953)，購自上海酶聯(lián)科技生物有限公司；上下游引物，均購自大連TaKaRa公司；無水乙醇、PBS等均購自上海生物工程有限公司。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號7500Fat)，購自美國AB公司；一般PCR儀(型號TC3000)，購自英國Techne公司；紫外分光光度計(型號NanoDrop2000)，購自美國Merin-ton公司；酶標(biāo)儀(型號MODEL550)，購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1樣品的收集及處理 活動性結(jié)核組、潛伏感染組于入院時，治療完成組于治療結(jié)束時，對照組于體檢當(dāng)日采集早晨空腹外周靜脈血5 mL，加入肝素鈉抗凝后以2 000 r/min離心 15 min，在30 min內(nèi)使用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取細胞miRNA，并檢測其濃度與純度，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作步驟嚴(yán)格按照說明書使用，反應(yīng)體系為500 g/L總RNA 1 μL，2×反轉(zhuǎn)錄緩沖混合物10 μL，RNase Free 水5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶2 μL，0.1% BSA 2 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。合成的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血漿中miR-155水平檢測 采用RT-qPCR法檢測，引物序列見表1，反應(yīng)體系為2×miRcute miRNA Premix 10 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL，正向引物0.4 μL，正向引物0.4 μL，總體積20 μL。參PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s，45個循環(huán)。溶解曲線分析條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s (收集熒光信號)，60 ℃ 15 min。每個樣品重復(fù)3次。使用U6為內(nèi)參基因，以U6的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，獲得各樣本的Ct值，通過Ct值計算miR-155表達水平，相對表達水平RQ=2-ΔΔCt(ΔCt = Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組)。

1.2.3血漿中SOCS1水平檢測 采用ELISA法檢測，試劑盒為SOCS1 ELISA試劑盒，檢測步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。

表1 miR-155及U6引物序列Tab.1 Primer sequences of miR-155 and U6

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1一般資料

4組研究對象的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組研究對象一般資料比較Tab.2 Comparison of general information in four groups

2.2血漿miR-155及SOCS1水平

結(jié)果顯示，對照組、治療完成組、潛伏感染組、活動性結(jié)核組血漿miR-155水平逐漸升高，SOCS1水平逐漸降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組研究對象血漿miR-155和SOCS1水平比較Tab.3 Comparison of plasma miR-155 and SOCS1 levels in four

2.3ROC評價血漿miR-155、SOCS1對肺結(jié)核的診斷價值

ROC曲線分析顯示，血漿miR-155、SOCS1診斷肺結(jié)核的AUC為0.938、0.808，當(dāng)miR-155水平>1.86、SOCS1水平<192.89 μg/L時，患肺結(jié)核的幾率較高，對應(yīng)的靈敏度分別為83.33%、93.335，特異度分別為92.56%、65.00%。見圖1、表4。

圖1 血漿miR-155和SOCS1診斷肺結(jié)核的ROC曲線Fig.1 ROC curves of plasma miR-155 and SOCS-1 in the diagnosis of pulmonary TB

表4 血漿miR-155、SOCS1對肺結(jié)核的診斷價值Tab.4 The diagnostic values of plasma miR-155 and SOCS1 in pulmonary TB

2.4肺結(jié)核患者血漿miR-155、SOCS1水平的相關(guān)性

Pearson結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者血漿miR-155、SOCS1水平呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.455，P<0.05)。見圖2。

圖2 肺結(jié)核患者血漿miR-155和SOCS1水平的相關(guān)性Fig.2 Person correlation plot of plasma miR-155 and SOCS1 levels in pulmonary TB

3 討論

肺結(jié)核是臨床常見的慢性傳染病，人群均容易受到感染，表現(xiàn)為低熱、盜汗、咳嗽、咯血及消瘦等癥狀，組織病理特點多為結(jié)核結(jié)節(jié)、空洞形成及干酪樣壞死[6]。有研究表明肺結(jié)核患者在發(fā)病后可以通過T淋巴細胞分泌干擾素、腫瘤壞死因子及白細胞介素(IL)等細胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)從而控制MTB[7-8]。

MicroRNA是一種小RNA分子，能夠在血清中穩(wěn)定存在，不會被RNA內(nèi)切酶降解，在強酸、強堿、高溫煮沸、反復(fù)凍融等條件下也不容易降解[9-10]。有研究表明，miRNA在腫瘤、心血管疾病以及肺結(jié)核、肺纖維化、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[6,11]，通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控靶基因的翻譯或表達[12-13]。miR-155是miRNA的重要成員之一，由B細胞集成簇(B cell integration cluster，BIC)基因活化而成，miR-155的免疫功能與其對SOCSl的調(diào)節(jié)有重要關(guān)聯(lián)[14]。SOCSl作為miR-155的重要靶基因之一，可負(fù)調(diào)控JAK/STAT通路，從而參與肺癌、肺結(jié)核及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[15]。miR-155最早被看做一個致癌基因，在肺癌、肺結(jié)核、胃癌、淋巴瘤、胰腺癌及白血病患者中表達水平顯著升高[16-18]，與腫瘤、癌癥等惡性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核治療完成組、結(jié)核潛伏感染組、活動性結(jié)核組患者血漿中miR-155水平逐漸升高，均高于對照組，表明miR-155在肺結(jié)核患者血漿中呈現(xiàn)高表達，與陳雪芳、曹帥麗等[19-20]的研究結(jié)果一致，提示miR-155可能與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。但這部分的結(jié)果已有相似的研究，未能形成亮點，因此本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，血漿miR-155水平對肺結(jié)核診斷價值的AUC為0.938，截斷值為1.706，其靈敏度、特異度分別為83.33%、92.56%，提示血漿miR-155對于預(yù)測肺結(jié)核有較高的診斷價值。

SOCS1是SOCS家族的一員，突變、甲基化等可導(dǎo)致SOCS1表達量減少，在腫瘤等惡性疾病發(fā)生、發(fā)展中有重要作用[21-22]。有研究表明，SOCS1可抑制不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有潛在的增值效應(yīng)，靶向SOCS1的基因治療對肺癌有很較好的效果[23]。包志瑤等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者外周血中SOCS1 mRNA表達水平明顯低于對照組，與胸部高分辨CT(HRCT)及血清IL-4水平呈負(fù)相關(guān)，提示SOCS1可能與IPF的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，可作為IPF疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)。楊紹俊等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)TLR2、SOCS1及miR-155在各組別中存在差異表達，SOCS1在活動型結(jié)核組中表達水平明顯高于正常組及潛伏型結(jié)核組，miR-155/SOCS1比值在活動型結(jié)核組中明顯低于正常組及潛伏型結(jié)核組，提示TLR2、SOCS1及miR-155在人外周血單個核細胞中的差異表達及miR-155/SOCS1比值對肺結(jié)核的診斷有一定的參考價值。本研究結(jié)果顯示結(jié)核治療完成組、潛伏感染組、活動性結(jié)核組患者血漿SOCS1水平依次降低，均低于正常對照組，表明SOCS1在肺結(jié)核患者血漿中呈現(xiàn)低表達，該結(jié)果與楊紹俊等[25]的研究結(jié)果不符，可能與患者個人差異或樣本量少等有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血漿SOCS1水平對肺結(jié)核診斷的AUC為0.808，截斷值為192.896，其靈敏度、特異度分別為93.33%、65.00%，提示血漿SOCS1水平與肺結(jié)核的發(fā)生密切相關(guān)，對肺結(jié)核具有一定的診斷價值。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-155、SOCS1在患者血漿中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示二者可能共同參與調(diào)節(jié)肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miR-155在肺結(jié)核患者血漿中呈現(xiàn)高表達，SOCS1在肺結(jié)核患者血漿中呈現(xiàn)低表達，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，對肺結(jié)核均有較高的診斷價值。但是由于樣本數(shù)量不多，尚有不足之處，今后將進一步擴大樣本數(shù)量進行研究。